正交试验优选肋柱花中獐牙菜苦苷的提取工艺研究

额尼荣贵 于红珍 巴根那 付明海*

1.内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000；2.国家药监局中药(蒙药)质量控制重点实验室，内蒙古 通辽 028000

肋柱花Lomatogoniumrotatum(L.)Fries ex Nym.是防治各种肝胆疾病的特色传统内服蒙药材，蒙语名为哈比日跟地格达，全草入药。味极苦,性寒、钝、糙、轻、燥，具有去除体内“ 协日”、清除内热、健胃、愈伤的功效。用于“ 协日”热、疫疠、流感、肝胆热、中暑头热、皮肤红肿发黄等，在蒙医临床上主要用于治疗肝胆类消化系统疾病[1]。肋柱花广泛分布于我国的内蒙古、西藏、青海、甘肃、新疆等地的山坡及丛林中[2]。1998年收录于卫生部药品标准蒙药分册，与山苦荬等配伍制成利胆二十八味散，用于降解胆囊“ 协日”热[3]。另，因其具有清肝胆热作用，可以作为君药配伍组成诸如地格达-15、地格达-20、地格达-25等方剂，用于治疗肝胆热、目肤红肿发黄、胆痞和“ 协日”滞瘀等导致脏器损伤的临床常见病症[4]。此外，肋柱花与黄连、栀子、瞿麦配伍组成蒙药方剂肋柱花四味汤(又称地格达-4)，用于咽痛、肝胆热、血热相搏、口渴烦躁等病症[2]。据统计肋柱花入药蒙药方剂共有24种，其中肋柱花以君药入药方剂有3种，以臣药入药4种，以佐药入药16种，以使药入药1种，是有别于其他民族医药用药习惯的特色蒙药道地药材[4]。现代研究[5-8]发现，肋柱花主要药理作用有保肝护胆、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗菌、减肥消脂作用。其化学成分主要以黄酮类、三萜类、环烯醚萜及裂环烯醚萜为主[9]。裂环环烯醚萜苷类化合物是一类具有保护肝脏、降低体内血脂血糖、抗炎镇痛、抗肿瘤、对神经系统及心血管系统有保护作用的天然活性分子[10]。獐牙菜苦苷属环烯醚萜类化合物，是肋柱花主要苦味活性成分。现代药理研究[11-12]表明，獐牙菜苦苷具有保护肝脏、调节血脂异常、抗糖尿病、抗炎镇痛和降脂等多种药理作用，可能是肋柱花药材的主要药效指标性成分。而目前对肋柱花活性成分的提取工艺和质量控制研究仍未见报道。文献显示，乙醇浓度、提取液用量、提取次数和时间是影响环烯醚萜类提取物的重要因素，可直接影响有效成分在提取物中的提取效果。因此，本文以獐牙菜苦苷作为活性指标成分，结合HPLC法和乙醇浓度、提取液用量、提取时间、提取次数等4个单因素考察结果，设计正交L9(34)试验，确定肋柱花中獐牙菜苦苷的最佳提取工艺，为特色蒙药材肋柱花进一步应用和开发提供参考。

1 材料

1.1 主要仪器 本研究所用的主要仪器有Agilent 1260 Infinity ii液相色谱仪，SQP型十万分之一分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，KQ-800E型超声波清洗器，SHZ-95B型循环水式多用真空泵，KDM型调温电热套。

1.2 主要药品与试剂 肋柱花药材采集于锡林郭勒盟(2020年9月25日)，经内蒙古民族大学蒙医药学院拉西那木吉拉教授鉴定为龙胆科肋柱花Lomatogoniumrotatum(L.)Fries ex Nym的干燥全草(如图1所示)。獐牙菜苦苷标准品(批号B21644 纯度≥98%)，购自原叶生物。甲醇，磷酸，无水乙醇为分析纯，水为超纯水。

图1 肋柱花全草图

2 方法

2.1 标准溶液的配置 精密称取獐牙菜苦苷标准品2.18 mg装置25 mL量瓶中加甲醇溶液溶解并稀释至刻度摇匀。超声波脱气 10 min 后再通过 0.45 nm 水系膜过滤，制成1 mL含0.0872 mg的溶液，进样量为10 μL，以獐牙菜苦苷质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

2.2 色谱条件 采用高效液相色谱法；色谱柱： ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm)5-Micron；流动相： 水-0.1%磷酸水溶液梯度洗0→70∶30,15→65∶35,25→50∶50；流速： 1.0 mL·min-1；检测波长： 254 nm；柱温： 30 ℃。采用正交设计助手计算实验结果及方差分析。

2.3 样品中獐牙菜苦苷含量的测定 将肋柱花粉碎制成粉末，精确称取肋柱花药粉5 g，按照L9(34)表格按照不同因素回流提取得浸膏并冷冻干燥。干燥粉末加适量甲醇溶解后，用 0.45 μL 滤膜过滤备用，按照色谱条件进行分析并计算苦味素的百分含量。

2.4 肋柱花獐牙菜苦苷提取工艺单因素实验 药材阴凉处晾干粉碎后，设计乙醇浓度×料液比×提取时间×提取次数4个因素的正交试验，获得獐牙菜苦苷的最佳提取工艺(表1)。

表1 单因素水平表

2.5 正交实验及验证 根据单因素实验结果，选择适宜的乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数并进行L9(34)表设计正交实验(表2)。

表2 正交试验的因素与水平表

3 结果

3.1 肋柱花獐牙菜苦苷含量测定方法学验证 由图2～4可知，獐牙菜苦苷保留时间为6.775 min，得到回归方程：y=641.66x+5.2603，线性范围在0.213～1.298 mg/mL，相关系数为R2=0.9997；精密度实验中RSD为0.26%，表明仪器的精密度良好；稳定性实验中24 h内獐牙菜苦苷含量测定结果的RSD为0.002%，表明供试品溶液在24 h内稳定；重复性实验中RSD为0.026%，表明重复性良好；加样回收率实验中RSD为0.084%。表明该法符合含量测定要求，综上所述均满足测定的要求。

图2 肋柱花供试品(A)和獐牙菜苦苷标准品(B)HPLC图谱

图3 獐牙菜苦苷标准曲线图

图4 各因素对指标成分含量的影响图

3.2 肋柱花獐牙菜苦苷提取工艺单因素试验

3.2.1 乙醇浓度的选择 精密称取肋柱花药材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取次数3次，提取时间2.0 h，分别设50%、60%、70%、80%、90%乙醇 5个浓度进行提取，计算獐牙菜苦苷峰面积含量， 结果如图4 A所示，獐牙菜苦苷含量在乙醇浓度为60%时达到峰值，故选择60%乙醇为提取溶剂。

3.2.2 提取次数的选择 精密称取肋柱花药材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取浓度50%，提取时间2.0 h，分别设1、2、3、4、5个次数进行提取，计算獐牙菜苦苷峰含量。如图4 D所示，獐牙菜苦苷含量在次数2时达到峰值，故选择2次。

3.2.3 提取时间的选择 精密称取肋柱花药材粉末5份，每份5 g，乙醇用量20倍，提取浓度50%，提取次数为1次，分别设0.5 h、1.0 h、1.5 h、2.0 h、2.5 h等 5个时间进行提取，计算獐牙菜苦苷含量。如图4 C所示，獐牙菜苦苷含量在时间2.0 h 时达到峰值，故选择2.0 h为提取时间。

3.2.4 提取溶剂量的选择 精密称取肋柱花药材粉末5份，每份5 g，提取时间为2.0 h，提取浓度50%，提取次数为1次，分别设1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的料液比进行提取，计算獐牙菜苦苷含量。如图4 B所示，獐牙菜苦苷含量在倍数1∶10时达到峰值，故选择1∶10倍量乙醇提取。

3.3 正交实验结果 正交实验方案及结果见表3，方差分析表见表4。结果表明，从R值和表4方差分析得知提取时间的影响最为显著。且提取最佳工艺为A2B1C2D1，即提取浓度60%，料液比1∶10，提取时间2.0 h，提取次数2。

表3 正交实验方案及结果

表4 方差分析

4 讨论

肋柱花属于地格达类蒙药，蒙语为哈比日干地格达，是一类特色道地蒙药材，组方或单方用于治疗肝胆疾病。以肋柱花为君药的地格达-4汤更是应用广泛，临床疗效显著。肋柱花主要化学成分獐牙菜苦苷为环烯醚萜类化合物，是含量最高的有效成分之一，占总比30.98%，具有保护肝脏、调节血脂异常、抗糖尿病、抗炎镇痛和降脂等作用[7]。由于环烯醚萜通常以苷的形式存在，采用不同提取溶剂或者提取方法都对药材中的物质有影响，环烯醚萜类易被水解，性质活跃，极性较大，易溶于水、乙醇、甲醇、丙酮、正丁醇等，故常用含水乙醇进行提取。郭小存等[13]在使用不同萃取法获得了龙胆中总环烯醚萜苷的工艺后发现回流提取法显著优于其他方法，并以回流提取法为基础,通过正交实验确认了最佳的萃取工艺为提取溶剂70%乙醇，提取时间2 h，料液比1∶15。黎珊等[14]通过设计的单因素和正交试验，优选出在鸡蛋花中总环烯醚萜的最佳萃取工艺为提取溶剂60%乙醇，提取时间1 h，料液比1∶25。张轲等[15]以平均回收率和总环烯醚萜的平均存在量为指标，经过正交试验的验证得出白花蛇舌草中总环烯醚萜苷的最佳萃取工艺是提取溶剂90%乙醇，料液比1∶8，提取时间2 h，提取次数2次。因此本实验选择乙醇浓度，提取用量，提取时间，提取次数4个因素进行单因素实验分析，并采用正交实验优化肋柱花中獐牙菜苦苷最佳提取工艺。

从单因素实验结果来看，乙醇浓度考察中峰面积在60%时达到峰值，随后逐渐下降。该结果与上述环烯醚萜类化合物的乙醇提取浓度接近，表明此类化合物在60%乙醇提取时含量可能最高。此外，提取次数2次时达到峰值，随着提取次数增多含量变少，故表明此类成分可能对热不稳定，加热时间越长含量越少。提取时间在0.5～1.5 h之间呈现平稳趋势，在2.0 h时达到峰值，表明在此时间段为最佳提取时长。料液比在1∶10时到达峰值，但随着比重的增加含量逐渐降低。正交实验结果得出最佳提取条件为乙醇提取浓度60%，料液比1∶10，回流提取1次，每次提取时间2 h。各因素影响力顺序为提取时间>乙醇浓度>提取用量>提取次数，其中提取时间和提取浓度的影响最为显著。但因为药物成份的复杂性，即使同一药材不同提取物中的环烯醚萜苷含量也会出现不同[15]。环烯醚萜类及苷类的化学性质并不稳定，回流加热时间过长也会对肋柱花中獐牙菜苦苷含量有一定的影响[16]。准确测定提取物中的含量以及筛选出准确专一的方法，还有待进一步完善。

5 结论

肋柱花作为蒙药特色道地药材，单用或组方使用在治疗肝胆疾病具有显著疗效，但对其主要有效成分獐牙菜苦苷的最佳制备工艺研究较少。本实验以獐牙菜苦苷的含量为指标，结合单因素考察和正交实验，对影响肋柱花中獐牙菜苦苷萃取的因素与条件加以优化，得到最佳提取工艺为乙醇提取浓度60%，料液比1∶10，回流提取1次，每次提取时间2 h，为进一步综合开发利用肋柱花药材打下了基础。