水蛭胶囊质量标准研究

杨元凤 杨仁惠 韩云霞 徐 冉 陈启乾 周训蓉*

1.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550003；2.贵州中医药大学医院制剂研发中心，贵州 贵阳 550003；3.贵州中医药大学医院中药制剂研究中心，贵州 贵阳 550003；4.贵州医科大学，贵州 贵阳 550004

糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病最常见的慢性并发症之一。发病初期，病情隐匿，患者不易于察觉，随着病情的发展，可致肌肉萎缩、四肢溃疡、坏疽，严重者甚至有截肢风险[1]。目前，临床上对DPN的治疗主要为西医对症处理，即胰岛素注射、营养神经、止痛、抗氧化等，全面控制血糖，改善肢体微循环，但临床效果有限，且药物长期服用毒副作用增多，患者难以坚持，影响疗效[2-4]。水蛭胶囊为我院医院制剂，前期临床研究表明，该制剂不仅能缓解消除DPN患者手足麻木、肢体疼痛、感觉障碍等临床不适症状，还能改善患者的感觉、运动神经传导速度[5]。为了保障患者临床用药安全有效，研究采用TLC法定性鉴别水蛭，采用凝血酶滴定法测定水蛭抗凝血酶活性[6-8]，为水蛭胶囊质量标准的建立提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 AB204S电子分析天平(上海菁海仪器有限公司)；HH-4数显恒温水浴锅(常州澳华仪器有限公司)；YHG-600-S-Ⅱ型红外快速干燥箱(贺德试器有限公司)；SX2式箱形电阻炉(长沙市远东电炉厂)；FA2204N型电子天平(上海菁海仪器有限公司)；舒美KQ-500DA型台式数控超声波清洗器(上海坤权生物科技有限公司)；微量移液器(Nichiryo Japan) ；H2-16K医用离心机(湖南可成仪器设备有限公司)；硅胶G板(德国Merck)。

1.2 试药 水蛭药材(批号:20180601，贵阳济仁堂中药饮片厂) 经贵州中医药大学第二附属医院韩云霞主任鉴定为水蛭科蚂蟥 (WhitmaniapigraWhitman)；水蛭(蚂蟥)对照药材(批号：121061-201806，中国食品药品检定研究院)；凝血酶(批号：T832140-1KU，2000U/支)、牛纤维蛋白原(批号：F823833)、三羟甲基氨基甲烷(批号：T819511)均购自上海麦克林生化科技有限公司；水蛭胶囊(批号：181101、181102、181103，按制剂处方量称取药材400 g，70～80 ℃常压干燥4 h，粉碎过80目筛，填充0#胶囊，分装，0.4 g/粒，即得)。乙醇、石油醚(60～90 ℃)、丙酮、碘等为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层鉴别 参照(《中国药典》[7]2015年版一部水蛭薄层色谱鉴别项下试验：取本品内容物1 g，加乙醇5 mL，超声处理15 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取水蛭对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验[9]，吸取上述两种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(3∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，碘显色，日光下检视。结果水蛭的供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。如图1所示。

1.水蛭对照药材；2-4：水蛭胶囊

2.2 抗凝血酶活性测定[6-8]

2.2.1 试药的配制

2.2.1.1 三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液 取 0.2 mol/L 三羟甲基氨基甲烷溶液25 mL与 0.1 moL/L 盐酸溶液约40 mL，加水至100 mL，调节pH值至7.4。

2.2.1.2 凝血酶溶液 取凝血酶(含2000 U) 试剂适量，加生理盐水溶解并配制成每1 mL含凝血酶40个单位的溶液。

2.2.1.3 供试品溶液 取水蛭胶囊内容物1 g，精密称定，加入生理盐水5 mL，充分搅拌，浸提 30 min，浸提过程中时时摇晃，3000转/min离心5 min，取上清液，即得。

2.2.2 抗凝血酶活性的测定 精密量取供试品溶液100 μL置试管中，加入含0.5%牛纤维蛋白原的三羟甲基氨基甲烷盐酸缓冲液(临用现配)200 μL，摇匀，置水浴中(37±1)℃温提5 min，在此过程中每1 min滴加 5 μL 凝血酶溶液(40 U/mL)，边滴加边轻轻摇晃直至可挑出白色絮状物，记录滴加凝血酶溶液的体积，按公式计算：U =C1V1/C2V2；式中U表示每1 g水蛭含凝血酶活性单位，U/g；C1表示凝血酶溶液的浓度，μ/mL；C2表示供试品溶液的浓度，g/mL；V1表示消耗凝血酶溶液的体积，μL；V2表示供试品溶液的加入量，μL。结果见表1。

表1 水蛭胶囊抗凝血酶活性测定结果

3 讨论

水蛭是我国传统虫类活血化瘀药，具有破血逐瘀、通经活络之功效[10]。现代药理学研究[11-13]表明，水蛭主要有抗凝血、抗血栓、降脂、抗细胞凋亡、抗肿瘤等药理作用，主要用于治疗心脑血管疾病、肿瘤、泌尿系统疾病、周围神经损伤等多个病种[14]。水蛭一般用其干燥全体研磨成粉末入药，但由于水蛭味咸、苦，直接打粉冲服，患者依从性差。我院中药制剂研究中心将其干燥粉碎后直接填充胶囊制成胶囊剂，制成的胶囊剂可以掩盖咸、苦味，提高患者依从性。通过临床验证，水蛭胶囊可明显改善 DPN 患者的疼痛、异样感等临床症状，并且有助于改善患者的神经传导速度[5]。为了保证制剂质量的可靠性和可控性，本研究对其薄层鉴别和抗凝血酶活性进行测定。

3.1 薄层鉴别 研究对展开系统、展开剂的比例及检视方法进行考察。预实验参照《中国药典》2015 年版一部水蛭薄层色谱鉴别项下的展开条件及显色检视方法进行试验，结果色谱斑点不清晰、拖尾严重，不易于鉴别。分别考察正己烷-乙酸乙酯(4∶1)、石油醚(60～90 ℃)-丙酮(6∶1)、石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(2∶1)三种展开系统展开，取出，晾干，经日光、10%硫酸乙醇-105 ℃加热、365 nm紫外灯及碘蒸气熏四种检视方式检视，综合比较分离度、斑点数目和拖尾情况，可确定石油醚(60～90 ℃)-丙酮(6∶1)为比较理想的展开系统以及碘显色为比较理想的显色检视方法。经进一步对石油醚(60～90 ℃)-丙酮展开系统的比例，结果表明以石油醚(60～90 ℃)-丙酮(3∶1)展开后，水蛭药材薄层色谱斑点的比移值合适且能很好分离。因此确定水蛭薄层鉴别的展开系统为石油醚(60～90 ℃)-丙酮(3∶1)，显色检视方法为碘显色。

3.2 抗凝血酶活性测定 水蛭的活性成分为水蛭素，是迄今发现的最强的凝血酶特异性抑制剂[15]。目前水蛭素含量测定方法有：凝血酶滴定法、纤维蛋白原平板法、生色底物的比色法、凝血酶原时间试剂盒法及光散射法等[16]。其中，凝血酶滴定法是一种简单经济，应用广泛的水蛭素活力测定方法。考虑到实验条件及经济成本，本实验选择凝血酶滴定法测定水蛭胶囊中水蛭素的抗凝血酶活性。实验结果表明，水蛭胶囊的抗凝血酶活性均值为142.0 U/g，高于《中国药典》2015年版一部水蛭含量测定项下水蛭中药材含抗凝血酶活性应不低于16.0 U/g的要求[7]。实验中所用生化试剂(三羟甲基氨基甲烷、凝血酶、牛纤维蛋白原)应冷藏在冰箱中，临用时现配制，否则测定得到的抗凝血酶活性结果不准确。滴加凝血酶的次数一般不要超过5次，如果次数太多，则溶液中纤维蛋白原的浓度会越来越稀，反应现象不明显。如果5次还没有出现白色絮状物则考虑稀释样品浓度。为了提高滴定的准确度，可梯度配备不同浓度的凝血酶溶液(即可由高浓度到低浓度逐步滴加)。同时在临近凝固点时，滴加凝血酶的量可以逐步减少，以此减少测定误差。