维吾尔药西帕依固龈液质量标准提升研究

苏来曼·哈力克 蒋晨昊

新疆维吾尔自治区药品检验研究院，国家药品监督管理局中药(维药)质量控制重点实验室,新疆 乌鲁木齐 830054

西帕依固龈液合剂是由单味药材没食子经提取制成的口腔抗感染国药准字号制剂，临床上广泛用于牙周炎、牙龈炎的治疗，效果显著[1-4]。本品具健齿固龈、清血止痛功效，可用于牙周疾病引起的牙齿酸软、咀嚼无力、松动移位、牙龈出血、口舌生疮、咽喉肿痛、口臭烟臭等症。标准收载于《卫生部药品标准-维吾尔药分册》(1998)[5]，标准号为WS3-BW-0122-98。原标准只有试管鉴别、薄层色谱鉴别和pH值测定项，未见质量标准研究文献报道。为了更好地控制产品内在质量，修订了性状、没食子酸的TLC鉴别，删去了化学鉴别，增加了其主成分没食子酸的HPLC含量测定，使质量标准可控性得到全面提高。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Waters 1525 Binary HPLC Pump，2487 Daul Absorbence Detector, Waters 717 Autosampler，Empower色谱工作站，岛津LC-20AT液相色谱仪及工作站，Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，定量毛细管(美国Drummond Scientific Company)，CAMMAG REPROSTAR3薄层色谱成像系统(瑞士CAMMAG)。Waters高效液相色谱仪(美国Waters公司)。

1.2 试药 西帕依固龈液(批号：20130108，20130109,20130112,20130114,20130116,20130117,20130118,20130143,20130144, 20130203,20130205)；没食子药材阴性对照液，均由新疆新奇康药业股份有限公司提供。没食子药材(批号：20110501,201108,20120925,20130612，分别购于新疆麦迪森药业有限公司、新疆热益罕维吾尔药材公司、新疆新奇康药业有限公司、和田安萨尔维吾尔药材公司)。对照品：没食子酸(批号：110831-200302供含量测定用，110831-200803含量为 90.3%)，购于中国食品药品检定研究院。没食子对照药材(批号：XJYJS-YC-201008，本院自制)。硅胶薄层板试剂(预制板)(中国青岛海洋化工集团公司出品)，水为超纯水，其它化学试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 性状描述 本品为淡黄色至淡棕色液体；气微香，味涩、微甜。

2.2 薄层色谱鉴别 取本品直接作为供试品溶液。取没食子酸对照品加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，作为对照品溶液。另取没食子对照药材0.1g加甲醇20 mL,超声处理20 min, 滤过，滤液浓缩至2 mL作为对照药材溶液。照薄层色谱法《中国药典》四部0502试验，吸取供试品和对照药材溶液各4μL,对照品溶液2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以二氯甲烷-甲酸乙酯-甲酸(5∶5∶1)为展开剂，展开，取出，挥干，置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。喷以1%三氯化铁乙醇溶液，供试品色谱中，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。如图1所示。

A: 254 nm 紫外光灯 B：1%三氯化铁乙醇溶液显色

2.3 HPLC含量测定 西帕依固龈液由没食子单味药材经提取制成。没食子(Turkish galls)化学成分中含鞣质(tannins)50%～70%、没食子酸(gallic acid)2%～4%、间-双没食子酸(m-digallic acid)、没食子酸甲酯(methyl gallate)、1，2，3，6-四-0-没食子酰基-β-D-葡萄糖(1，2，3，6-tetra-O-galloyl-β-D-glucose、1，2，3，4，6-五-O-没食子酰基-β-D-葡萄糖(1，2，3，4，6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)、树脂等成分[6]。没食子酸含量测定方法报道中，彭燕等[7]用差示分光光度法测定西帕依固龈液中没食子酸的含量，结果样品含量为6.85～9.79 mg·mL-1，测得值偏高。司马义江等[8]报道，HPLC法测定西帕依固龈液中没食子酸含量为0.03489 mg·mL-1，含量明显偏低。吴雪钗等[9]研究报道没食子酸为弱极性物质，在强氧化条件下降解迅速，不稳定；当pH值为7.0～10.0时，3 h 已降解完全，极不稳定；而对强酸、强光、高温较稳定；当pH值为2.0～6.0的条件下，即酸性环境中稳定。本研究参考文献方法，经多次预试验，采用梯度洗脱建立了西帕依固龈液中没食子酸的HPLC含量测定方法。

2.3.1 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品适量，精密称定，置于棕色量瓶中，加甲醇制成 15 μg·mL-1的溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 西帕依固龈液为水溶液，其主成分没食子酸易溶于水。分别精密量取样品1 mL，分别加水、50%甲醇和甲醇稀释至 100 mL，按上述方法考察其峰面积。结果用水和50%甲醇稀释处理的样品峰面积差异不大，甲醇稀释液样品峰面积略高，因水经济且环保，故选择用水稀释样品。

2.3.3 阴性对照液的制备 按处方辅料比例及工艺制备缺没食子的阴性对照液，并按上述“2.3.2”项下方法制备阴性对照液。

2.3.4 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Agilent TC-C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)，以甲醇为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B,按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长273 nm。理论板数按没食子酸峰计算应不低于8000。西帕依固龈液样品、阴性对照及没食子酸对照品HPLC色谱图如图2～4所示。

图2 西帕依固龈液样品HPLC色谱图

表1 流动相系统程序

2.3.5 线形关系考察 精密称取没食子酸对照品7.54 mg置10 mL量瓶中，加甲醇适量溶解并定容至刻度，摇匀，制成每1 mL含没食子酸0.754 mg的储备液。精密吸取此储备液适量加甲醇制成每 1 mL 含没食子酸0.4 μg、2 μg、15 μg、20 μg、40 μg、80 μg和100 μg的系列浓度对照品溶液，分别进样10 μL，以对照品峰面积(Y)为纵坐标，对照品质量(X，μg)为横坐标，进行线性回归计算，得回归方程为：Y=4×106X-7865.5，r=0.9991。结果表明，没食子酸对照品在0.04～100 μg/mL 范围内，呈良好的线性关系。

2.3.6 精密度试验 取没食子酸对照品溶液(16.42μg/mL), 重复进样6次，每次10 μL，记录没食子酸的峰面积值，计算相对标准偏差，结果RSD=0.2%，显示仪器精密度良好。

图3 西帕依固龈液阴性对照HPLC色谱图

图4 没食子酸对照品HPLC色谱图

2.3.7 稳定性试验 取同一供试品溶液，室温下放置，每隔一定时间，进样10 μL, 连续进样6次依法测定没食子酸峰面积值，计算相对标准偏差，24 h内RSD为2.51%。结果表明，供试品溶液室温放置24 h内稳定。

2.3.8 重复性试验 取同一供试品溶液6份，分别进样10 μL,依法测定没食子酸峰面积值，计算相对标准偏差，结果RSD为1.40%，方法的重复性良好。

2.3.9 加样回收率试验 精密量取同一供试品 0.5 mL 置100 mL量瓶中，同时制备6份。精密称取没食子酸对照品10.16 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，精密量取1 mL置 25 mL 量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得(0.4064 mg·mL-1)。分别置供试品中精密加入每1 mL含没食子酸0.4064 mg的对照品溶液2.0 mL，加水稀释至刻度，摇匀。按上述色谱条件测定，计算回收率，结果没食子酸平均回收率(n=6)为99.28%, RSD为1.21%。

2.3.10 样品测定 分别精密量取11批样品溶液各 1 mL， 按2.3.9项下方法测定，记录HPLC图谱，外标法计算含量，结果没食子酸含量在1.07～1.36 mg·mL-1之间,平均(1.17±0.134)mg·mL-1(n=11)。根据上述测定结果，以平均值1.17下浮20%其值为0.94，暂定西帕依固龈液含没食子按没食子酸(C27H30O16)计，应不得少于0.90 mg/mL。测定结果见表2。

表2 西帕依固龈液中没食子酸含量测定结果 (n=2)

3 讨论

3.1 HPLC法流动相的选择 西帕依固龈液为水溶液，其主成分没食子酸易溶于水，样品液直接加水稀释成一定量测定简便可行。流动相曾用《中国药典》一部五倍子项下没食子酸含量测定用的甲醇-0.1%磷酸(15∶85)，结果出峰时间较长且没食子酸峰得不到基线分离，有杂峰干扰。改用甲醇-0.1%磷酸(6∶94),流速：1.0 mL/min ，柱温：30℃，没食子酸峰得到基线分离，但杂峰出尽需80 min。后经多次改变梯度洗脱条件，确定流动相为：甲醇A-0.1%磷酸B，按文中梯度洗脱程序，时间缩短为30 min，分离效果满意。

3.2 有害元素测定 照《中国药典》2020年版四部通则2321铅、镉、砷、汞、铜测定法(电感耦合等离子质谱法)测定了11批次供试品中的铅、汞、铜、总砷、镉含量，结果均未检出或未超出相关规定。

3.3 农药残留测定 照《中国药典》2020年版四部通则2341农药残留量测定法测定11批次样品中的六六六、滴滴涕、林丹、七氯、艾氏剂含量及氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、溴氰菊酯、三氯杀螨醇含量，结果均未检出。

3.4 原料没食子中没食子酸的含量测定 为了控制原料没食子的质量，采用前述制剂含量测定方法，对没食子进行了含量测定。精密称取没食子药材粉末(过3号筛)0.1 g，至25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇适量，超声处理15 min，放置室温，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。其余同西帕依固龈液的测定。测定4批次没食子药材样品，结果按干燥品计含没食子酸(C7H6O5)为1.52%～4.60%，平均为2.86%。

本文新建立的方法，根据11批次样品性状实际观察，将原标准性状鉴别描述“本品为淡棕色液体”修改为“本品为淡黄色至淡棕色液体”；删除专属性差的试管鉴别项；对原薄层色谱鉴别项因色谱斑点拖尾，将提取过程简化为直接点样，采用新展开剂系统，结果色谱斑点清晰稳定；为控制制剂内在质量，新增主成分没食子酸HPLC法含量测定，没食子药材中没食子酸含量不低于1.50%，制剂中没食子酸含量不低于0.90 mg/mL。整个质控方法简便、准确、可靠，使西帕依固龈液的质量标准得到显著提升。