HPLC-DAD法测定健心颗粒中人参皂苷Rg1、Rb1含量

张 宽 郑 笈 谢玉和 谢晶心 严锦贤

福建中医药大学附属第二人民医院，福建 福州 350003

健心颗粒是依据我院陈美华主任基于中医辨证为“心阳气虚，血瘀水停”的经验方“健心汤”而制成的院内制剂，临床使用十余年，用于治疗慢性心力衰竭疗效显著。方药组成包括黄芪、红参、丹参、猪苓、白术、葶苈子、蒲黄、桂枝共八味药，具有益气活血、温阳利水之功效。健心颗粒是通过现代工艺技术加工制成的新型中药制剂，与传统汤剂相比，具有便于携带、使用方便、口感较好的特点，患者更易接受，因此对其指标性成分进行控制，保证制剂质量的均一、安全、有效尤为重要。红参为健心颗粒的君药之一，且属于贵重中药，故拟制定HPLC测定人参皂苷Rg1、Rb1含量的方法，以期为该制剂的质量控制提供有效手段。

1 仪器与试药

戴安U3000高效液相色谱仪，PDA-100 光电二极管阵列检测器(Somerfeld Fisher Scientfic(中国)有限公司)；SB-5200DT超声波提取器(宁波新芝生物科技股份有限公司，批号：131897)；BSA224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司，批号：2014-03)。健心颗粒由福建中医药大学附属第二人民医院提供(批号：202007004、202009006、202011002)。人参皂苷Rg1对照品(批号：181010)，人参皂苷Rb1对照品(批号：15102910)均购于中国食品药品检定研究院。乙腈为色谱纯；水为超纯水；其他其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱为SinoeChrom ODS-BP(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱(0～10 min，23%～25%A；10～20 min，25%～25%A；20～30 min，25%～30%A；30～45 min，30%～40%A)；流速：1 mL/min；检测波长203 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。如图1所示。

A.供试品溶液；B.混标对照品溶液(1-人参皂苷Rg1；2-人参皂苷Rb1)

2.2 对照品溶液制备 精密称定人参皂苷Rb1对照品0.0110 g于10 mL容量瓶中，加入甲醇，超声溶解，定容，得到浓度为1.100 mg/mL的人参皂苷Rb1对照品贮备液。精密称定人参皂苷Rg1对照品0.0096 g于10 mL容量瓶中，加入甲醇，超声溶解，定容，得到浓度为0.9600 mg/mL的人参皂苷Rg1对照品贮备液。

2.3 供试品溶液制备 取健心颗粒粉末5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50 mL甲醇，称定重量，放置过夜，超声处理30 min(250 W 40 kHz)，放至室温，甲醇补足减失重量，摇匀，过滤，取上清液，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4 标准曲线制备 精密量取人参皂苷Rb1、Rg1对照品储备液适量，置于5 mL容量瓶中，加入甲醇稀释至刻度，用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液。得到含有人参皂苷Rb1、Rg1混合对照品溶液，其中人参皂苷Rb1的浓度为209.5 μg/mL，人参皂苷Rg1的浓度为2.744 mg/mL，稀释成一系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品溶液浓度(C)为横坐标x，峰面积(A)为纵坐标y，得回归方程：人参皂苷Rg1：y=92.687x+7.0482(r=0.9990)，线性范围为0.09143～2.744 mg/mL；人参皂苷Rb1回归方程：y=14.55x+0.1452(r=0.9994)，线性范围为26.19～209.6 μg/mL。如图2所示。

图2 标准曲线图

2.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 10 μL，按2.1项下色谱条件连续进样6次。人参皂苷Rb1峰面积RSD为1.45%；保留时间(tR)RSD为1.71%，人参皂苷Rg1峰面积RSD为0.60%；保留时间(tR)RSD为1.26%，表明该仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 精密称定健心颗粒约5.0 g，按“2.3”项下制备供试品溶液，于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h按“2.1”项下色谱条件进样。人参皂苷Rb1峰面积RSD为1.13%，人参皂苷Rg1峰面积RSD为1.27%，说明该供试品在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 精密称定健心颗粒约5.0g，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，平行操作6次。人参皂苷Rb1的平均含量为1.734 mg/g，RSD为1.71%，人参皂苷Rg1的平均含量为22.53 mg/g，RSD为1.25%，说明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取同批健心颗粒6份，每份约5.0 g，均精密加入人参皂苷Rb1、Rg1对照品溶液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样。人参皂苷Rb1的平均加样回收率为102.0%，RSD为1.76%，人参皂苷Rg1的平均加样回收率为101.3%，RSD为1.49%，说明该方法准确性高。

2.9 样品含量测定 取3个批次健心颗粒(批号为202007004、202009006、202011002)，分别按上述方法制备供试品溶液，并测定人参皂苷Rb1、Rg1含量。结果见表1及图3所示。

表1 不同批次健心颗粒中人参皂苷Rb1、Rg1含量测定结果 (n=3)

图3 不同批次健心颗粒HPLC色谱图

3 讨论

3.1 人参皂苷Rg1、Rb1可作为健心颗粒制剂的质量标志物 健心颗粒是我院治疗慢性心力衰竭的常用制剂，研究[1-3]证实，其可以改善心衰大鼠左室功能，并能减少尾加压素Ⅱ(UⅡ)、钙调神经磷酸酶(CaN)的表达，在抗心肌纤维化及抗心肌重构方面发挥显著作用。此外，健心颗粒还可以抑制TNF-α诱导的KLF4 mRNA表达，进而干预血管内皮细胞炎症损伤[4]。为保证制剂在临床发挥稳定的疗效，对制剂的内在质量进行监控的重要手段是对制剂中有效成分进行含量控制[5]。笔者对健心颗粒建立了HPLC法测定其君药红参中主成分人参皂苷Rg1、Rb1的含量，由于人参皂苷Re峰较难检出，不利于定量分析方法的建立，故排除其作为指标成分。文献报道显示：人参皂苷Rg1、Rb1都是人参治疗心衰的活性成分[6-7]，人参皂苷Rb1能够从抑制心肌组织TGF-β1含量、影响periostin蛋白表达进而调控TGF-β信号通路，抑制心室重构，防治心力衰竭[8]。人参皂苷Rg1可改善心衰大鼠的心功能，此外对异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚也具有保护作用[6,8]。因此，从药效学角度考虑，人参皂苷Rg1、Rb1可作为健心颗粒制剂的质量标志物。

3.2 提取方法考察 试验考察了药典方法[9]和超声提取法，结果显示，两种方法对人参皂苷Rg1、Rb1的提取率差别不大，而超声提取法操作步骤更简单，有机溶剂使用较少，更适合作为健心颗粒制剂质量质控的提取方法。

3.3 后期工作方向 红参是人参的常用炮制品，蒸制过程中，部分化学成分发生变化，因此在质量控制环节，也可以选择红参特有的化学成分如20(S)-ginsenoside Rh1与20(S)-ginsenoside Rh2[10]作为检测指标，该内容可作为后期工作的一个研究方向。

综上所述，人参皂苷Rg1、Rb1色谱峰在203 nm有较大的吸收峰，且分离度较高、峰形良好无干扰，经过方法学验证，精密度高、重复性好、专属性强、实验操作步骤简单，以人参皂苷Rg1、Rb1为指标性成分对3批健心颗粒进行考察，三批制剂成分含量差异不大，说明制剂生产工艺稳定可靠，可为该制剂的质量控制提供参考。