环介导等温扩增技术在新型冠状病毒检测中的应用研究进展

周振杰，王冬梅，欧阳松应,2

(1.福建师范大学生命科学学院，福建 福州 350117；2.福建师范大学南方生物医学研究中心，福建 福州 350117)

2019年末爆发的新型冠状病毒肺炎(简称新冠肺炎，COVID-19)对全球公共卫生安全构成巨大挑战，根据世界卫生组织的数据统计，截至2022年6月12日，全球新冠肺炎患者数量已超过5.4亿人，累计死亡人数已超过633万人.随着新型冠状病毒(SARS-CoV-2)变异株(例如Alpha、Beta和Delta等)，特别是Omicron新型变异毒株的出现，全球新冠新增确诊病例数量经历了多次起伏，一直未能得到完全控制[1].防止SARS-CoV-2传播的最重要对策是及早识别、隔离和监测患者.现阶段我国采用“抗原+核酸”组合检测，抗原检测用于居家自测和更快速的初筛，但其灵敏度低并会出现假阴性结果的风险；核酸检测即实时荧光定量PCR(qPCR)检测限低、特异性强，但其依赖于先进设备分析和专业人员操作，扩增耗时长，限制了其现场即时诊断(point-of-care testing，POCT)的能力.新兴的环介导等温扩增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)具有替代常规qPCR的潜力，已经以各种形式应用于SARS-CoV-2检测，最低检测限可达1～10 copies/反应，比传统的RT-PCR方法灵敏度高约100倍[2]，由于LAMP容易出现非特异性扩增而产生错误的结果[3]，研究人员根据实际检测SARS-CoV-2需求对该技术进行了改进，主要集中在增强特异性、提高反应速率、简化样本处理、实现多重扩增以及应用于现场检测平台等方面[4].本文回顾了近年应用于检测SARS-CoV-2的LAMP技术，同时总结了新型LAMP检测技术在简单化、快速化、特异化和产物检测等方面取得的进展.

1 LAMP的基本原理及检测流程

环介导等温扩增是Notomi等[5]在2000年首次提出的一种新型核酸扩增技术，该技术通过设计2对引物(内引物FIP与BIP，外引物F3与B3)特异性识别靶序列6个不同区域，同时设计1对环引物(LF与LB)增加反应速度(引物结构见图1)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在60～65 ℃恒温条件下反应15～60 min可特异、快速、高效完成核酸扩增.LAMP反应成功的关键是引物设计，需要注意的是内引物(FIP和BIP)会自行折叠，容易形成发夹结构；大量的引物(通常为6条)可能形成引物二聚体，这些交互作用容易产生假阳性结果[6].现在LAMP引物设计通常采用在线程序Primer Explore(http：∥primerexplorer.jp/)，导入靶基因自动生成引物，之后LAMP引物通过一系列因素进行优化，例如Tm值、引物末端的稳定性、G+C含量和引物之间的距离等.

图1 LAMP引物结构[7]Fig.1 LAMP primer structure[7]

LAMP检测较其他核酸诊断方法的最大优势在于操作流程简单，对仪器设备和人员要求低.LAMP检测步骤(见图2)包括：(1)标本采集：核酸检测流程的第一步，标本放入样本保存管中，其保存液具有灭活病毒的作用；(2)标本转运：标本在严密包装下护送到实验室；(3)提取核酸：专业技术人员提取病毒样本的核酸；(4)配制试剂、加样：将反应液、酶、引物和模板按照规定的量制备；(5)LAMP扩增：置于水浴锅或恒温设备中进行反应，在1 h内即可完成扩增；(6)结果输出：检测人员对扩增结果进行分析，排除假阴性和假阳性可能，及时对异常结果样本进行复核.结果判读方法多种多样，包括电泳法、比色法、侧流层析法、实时监测、微流控技术和电化学传感器等技术.

图2 LAMP检测流程图Fig.2 LAMP detection flowchart

2 LAMP检测SARS-CoV-2靶基因的方式

2.1 单基因LAMP

SARS-CoV-2基因组全长大约30 Kb，两端为非编码区域，中间是非结构蛋白编码区和结构蛋白编码区.非结构蛋白编码区序列保守包括5’端开放阅读框(open reading frame，ORF)ORF1a/b，占全基因组的67%，主要编码16个非结构蛋白(nonstructural protein，Nsp)，而结构蛋白编码区依次编码刺突蛋白(S)、包膜蛋白(E)、膜蛋白(M)及核衣壳蛋白(N)[8-9].N基因是LAMP 检测SARS-CoV-2最常用的靶基因，N蛋白的序列高度保守，在病毒复制过程中发挥重要作用.Dong等[10]对19组RT-LAMP引物进行比较评价，这些引物组在SARS-CoV-2的基因组中的分布包括2组与Nsp3结合、5组与RdRp结合、2组与E基因结合、6组与N基因结合，这些区域高度保守，另外4组引物分别位于Nsp1、Nsp3和S基因的基因组区域.而基于N基因的RT-LAMP方法扩增速度最快，并且比基于其他基因的检测更灵敏，最低检测限可达1 copies/反应.

2.2 多重LAMP

多重环介导等温扩增(multiplex LAMP，mLAMP)可实现同时检测多重基因的需求.SARS-CoV-2感染的早期临床特征类似于常见呼吸道病毒的感染，如流感病毒和军团菌[11]，但SARS-CoV-2的死亡率更高，并且进化的单碱基突变株比野生型SARS-CoV-2更具传染性和致死性，除此之外多重病毒合并感染的几率也很高[12]，因此，多重检测和突变基因分型对于评估病毒的传播性和致病性变得越来越重要[3].Kundrod等[13]针对N、E和ORF1a基因设计了3组独特的引物集识别SARS-CoV-2基因组的不同区域，降低了病毒突变对扩增的影响.研究表明与单引物组相比，RT-LAMP使用3个引物组可以提高灵敏度，加快扩增速度，在50 copies模板浓度上有显著差异.基于CRISPR的LAMP检测需要多种CRISPR-Cas相关酶进行切割，而Ye等[3]开发了一体式Ago切割的RT-LAMP检测系统(MULAN)，该系统设计和检测更简单；Manzanas等[14]开发的2-Plex VLEAD设备集成了球型阀门输送试剂、裂解病毒并在纸垫上浓缩和纯化、采集的RNA直接RT-LAMP扩增，然后进行比色分析，该设备成本低、使用简单，这两种方法都适用于检测SARS-CoV-2的不同变种、流感病毒亚型(A型和B型)或其他类型的病毒.

3 LAMP检测SARS-CoV-2的应用

3.1 电泳LAMP

由于LAMP扩增产物是不同数量的颈环结构、不同长度的DNA混合物，通过琼脂糖凝胶电泳法可见特异的梯状条带.该方法操作繁琐且容易产生气溶胶污染，多用于验证LAMP.

3.2 可视化LAMP

3.2.1 比色法LAMP

比色法LAMP(colorimetric LAMP ，cLAMP)是指反应前在体系中加入染料，通过观察LAMP反应前后颜色变化差异实现快速判读反应结果，适用于POCT.在检测低拷贝数样本时，RT-LAMP中琼脂糖凝胶法显示阳性，但比色法没有颜色变化，可能由于扩增子的形成少，这表明比色法诊断灵敏性较低[6].改进方法：(1)采样时期的选择：低病毒拷贝数下的检测率取决于采样时间和扩增时间，在早期感染期间病毒载量很低，直到出现症状的第五天，病毒载量就相对较高，此时比色LAMP对新冠肺炎的诊断是有效的[15]；(2)增加扩增时间：当延长LAMP反应时间至50～60 min时，病毒载量较低的样品也可被明显区分开；(3)比色法定量：Aoki等[6]利用分光光度仪分析酚红-LAMP检测SARS-CoV-2的结果，阳性反应中粉红色的强度降低、黄色的吸光度增加，从而通过ΔDO值(粉红色吸光度减去黄色吸光度即434～560 nm)进行客观的颜色测定；Yoo等[16]基于平板电脑自动图像捕获和编写测试算法，引入了DEF(决定性、有效性和模糊性)对HNB-LAMP的颜色变化进行分析，量化比色增加可视化的灵敏度.(4)使用新型混合染料：利用颜色之间的互补作用，使变色范围变窄，从而使终点时颜色变化敏锐[17].Jaroenram等[18]将二甲酚橙(XO)与孔雀石绿(MG)结合成复合染料称为薰衣草绿(LG)，带来了一种新的RT-LAMP比色系统对SARS-CoV-2进行检测，紫色

表1 SARS-CoV-2检测的LAMP比色指示剂Tab.1 LAMP colorimetric indicator for SARS-CoV-2 detection

3.2.2 LFD法

横向流动试纸条检测(lateral flow dipstick，LFD)包括LAMP扩增和横向侧流试纸条分析2个步骤，由于内引物与环引物被标记上生物素与地高辛，扩增反应形成双标记产物，然后产物通过横向层析与结合垫上偶联地高辛抗体的金磁微粒、检测线上生物素抗体及质控线上的其他抗体结合，从而显示出特定颜色[8]，通过不同的修饰物(FITC、Texas Red、荧光素、DIG等)标记不同靶标引物就可以实现双重[26]、三重[27]靶点的检测.Waller等[27]将mRT-LAMP-LFIA利用移液机器人和位置传感器来确保精度和重复性，实现完全自动化，能在15 min内检测到SARS-CoV-2三个不同的基因靶点(ORF1ab、E和N)，检测限低至3 copies/反应.横向流动LAMP检测具有判读方便、设备简单等特点，但其在反应后需要开盖进行杂交，这一步骤可能会引起污染造成假阳性.

3.3 实时LAMP

3.3.1 实时浊度法

利用实时浊度仪对LAMP反应过程中产生的焦磷酸镁沉淀进行浊度监测，LAMP实时浊度监测比传统的RT-PCR实时荧光监测更简单[28].Chen等[29]通过实时浊度监测来确定SARS-CoV-2 RdRp和N基因的RT-LAMP最佳扩增温度，测试了60～67 °C的反应温度，间隔1 °C得出对应的扩增曲线，浊度>0.1是阳性.Kitagawa等[30]通过LA-200浊度计对RT-LAMP扩增产物进行实时检测，以10倍连续稀释的SARS-CoV-2 RNA为模板，在35 min内的检测下限为10 copies·μL-1.

3.3.2 荧光定量法

基于SYBR Green I、SYTO系列等荧光染料与双链DNA结合的实时荧光，赵大重[31]通过SYBR Green I荧光染料进行SARS-CoV-2检测的LAMP体系优化，选择扩增曲线标准、出峰时间最早、最终达到的荧光信号值大为最优体系，并观察熔解曲线中空白对照没有出现非特异性扩增.Oscorbin等[32]以MS2噬菌体为内参照，通过荧光插层染料LAMP扩增结合熔融曲线分析进行实时检测SARS-CoV-2，与实时荧光定量PCR结果的符合率为97.6%，最低检测限为20 copies/反应.基于荧光共振能量转移的实时荧光，Dong等[33]使用HFman-LAMP，荧光探针与LF或LB具有相同序列并分别在3′端和5′端标记荧光团和猝灭剂，由于探针被高保真DNA聚合酶切割，释放出的荧光信号呈指数增加.因此可以简单地通过荧光强度来实时监测扩增反应，还可以针对SARS-CoV-2的ORF、E基因以及人类看家基因β-肌动蛋白在不同序列的HFman探针上使用不同的荧光基团来实现多重检测.对于探针法还有研究者引入校对酶和荧光探针的LAMP(RT-Proofman-LAMP)[34]提高扩增效率；开发了环探针LAMP(oLAMP)[35]提高灵敏度.

3.3.3 BART和实时测序

Iijima等[28]建立了一种新型RT-LAMP-BART检测SARS-CoV-2(野生型和4种变异型)，BART的原理是通过萤火虫荧光素酶产生的生物发光，连续监测核酸扩增的副产物(PPi)转化为ATP的过程.该检测显示了一个光输出峰值，即在最初几分钟内光输出下降后，如果光信号显著增加，则认为样本是阳性，随后光输出下降.虽然RT-LAMP-BART不如传统的实时RT-PCR灵敏度高，但它产生结果的速度更快.Ptasinska等[36]将LAMP和纳米孔测序(LamPORE)耦合进行快速实时测序分析SARS-CoV-2或其他病原体.实时监测比其他方法灵敏度高，但不适合现场即时检测.

3.4 微流控LAMP

微流控芯片微小可控、功能齐全，能够简化操作过程、加快分析速度，还可避免常规方法中样品转移所带来的污染和损失，LAMP与微流控技术结合的核酸扩增检测系统最有潜力被应用在POCT上[37].目前博奥晶芯生物科技有限公司的全集成碟式芯片法(LAMP恒温扩增)新冠核酸试剂盒已获批，对于最新毒株也可以做到不脱靶不漏检，35 min内检测灵敏度可达150 copies·mL-1.Nguyen等[38]开发了一个完全集成的离心式微流控平台可以一次对10个样品进行qLAMP扩增分析，并设计了3个反应室来靶向SARS-CoV-2的ORF1 ab、N和S基因，减少了假阳性和假阴性的错误结果，提高了准确性.Yang等[39]利用灵敏的RT-LAMP来增强信号，然后通过特异的人绒毛膜促性腺激素(HCG)连接的足趾介导的链交换(TM)探针(HCGP)将其转导到便携式商业妊娠试验试纸(PTS)，整个检测集成到一个四通道、手掌大小的微流控装置，并成功应用于SARS-CoV-2的M、N基因的检测，其最低检测浓度为0.5 copies·μL-1.

3.5 与其他技术联合的LAMP检测

Nguyen等[40]制作了一种将LAMP与聚多巴胺相结合的可滑动纸质装置可在25 min内检测到SARS-CoV-2，在DNA扩增子存在时阻碍了聚多巴胺变成聚集态，而在没有扩增时促进了聚多巴胺的聚集.纸张的多孔性使得阳性样品中分散的聚多巴胺能够在毛细管流动，而阴性样品中聚集态的聚多巴胺由于聚集体较大而留在纸条的底部.Day等[41]开发了一种乳化环介导等温扩增(eLAMP)平台诊断SARS-CoV-2，LAMP反应的分隔导致乳状液特性变化更快，从而降低检测时间.在这些液滴中，LAMP反应产生扩增子吸附到水-油界面使界面张力降低，导致乳状液直径变小，从而利用分光光度计和光纤光缆通过角度相关的光散射强度(基于Mie散射理论)来监控反应乳化剂直径的变化.Alvarez等[42]使用基于Arduino的pH微电极辅助的便携式LAMP扩增系统，对于未提取的病毒载量中等或低的唾液样本，扩增3 min即可准确可靠地诊断SARS-CoV-2，扩增过程中固有的H3O+离子的释放通过电势的差异或pH变化来实时监测.但是这种诊断系统的性能依赖于相对昂贵的商用pH微电极，而且玻璃或膜的pH微电极可能是样品中残留DNA 的污染源(来自之前的阳性扩增)，因此还需要建立能够在完成扩增实验后有效地将电极上残存核酸去除的方案.Song等[43]研究了一种嵌套等温扩增(Penn-RAMP)包括重组酶等温扩增(RT-RPA)作为其第一阶段，LAMP作为其第二阶段，与单步扩增的逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)同时检测CT<32的SARS-CoV-2进行比较，Penn-RAMP的灵敏度是RT-LAMP的10倍.

CRISPR系统特异性识别序列将减少等温扩增步骤中副产物造成的假阳性结果，从而提高特异性[44].Cas12蛋白也被广泛用于基于CRISPR/Cas的SARS-CoV-2核酸检测.在识别特定的靶核酸后，Cas12或Cas13核酸酶的非特异性反式切割活性被激活，从而切割报告探针，因此这些方法大多使用荧光探针，需要特殊的仪器来监测荧光信号[45]；还有研究应用耐热的Cas12b与RT-LAMP结合一体式检测SARS-CoV-2[46].基于Cas12的方法依赖于侧向流动分析[47]、离心机的使用[48]或磁力下拉操作[49]等，这些方法对于高通量检测是困难的.Cas13由于其敏感性在检测RNA病原体方面比Cas12更具优势[44].Mahas等[50]使用RT-LAMP偶联mCas13(一种新的Cas13变体)系统检测SARS-CoV-2，使用手持、廉价的荧光显像仪输出荧光信号，这是一种适用于POC和简单读数的常规诊断，但也不适合高通量筛查.纳米金(AuNP)因其较强的摩尔吸光系数而被用于可视分析， Zhang等[24]建立了一种Cas12a辅助结合AuNP目测的RT-LAMP扩增方法(CLAP)，从肉眼可以观察到红色变成紫色，基于这两种方法操作简单，有望在POCT中得到应用.

4 LAMP检测SARS-CoV-2的改进

4.1 样品处理简单化与快速化

现阶段应用于SARS-CoV-2核酸检测的核酸提取方法包括离心吸附法、磁珠法、试剂盒提取，这些方法需要专门的昂贵设备和试剂，并且非常耗时[51].而超速提取和免提取核酸的设计可以大大缩短SARS-CoV-2核酸提取的时间，提高LAMP检测效率[52].目前快速提取SARS-CoV-2核酸的方法不断改进：He等[53]探索了一种基于硅羟基MBS快速提取SARS-CoV-2 RNA的方法，实现核酸的自动提取，MBS结合RNA分子的能力很强，当被MBS捕获后，RNA与MBS一起直接用于下游的RT-LAMP反应；由于唾液可自行收集并保护了采集人员，Amaral等[54]建立了一种RT-LAMP直接从唾液样本中检测SARS-CoV-2，但是灵敏度较低.，研究人员对唾液进行不同的处理，结合某些化学物质和蛋白酶K可以改善唾液样本中SARS-CoV-2的检测.

Mautner等[55]在90 °C加热拭子样品5 min后，直接用于RT-LAMP检测；Ganguli等[56]将拭子移到病毒传输介质(VTM)，95 ℃热裂解1 min，直接取一定体积VTM进行RT-LAMP分析，该方法30 min内可检出50 copies·μL-1.Jones等[57]将20 μL样品与2×LAMP裂解缓冲液混合：2%Triton X-100调节至pH=8.0，2 mol·L-1Tris-HCl和80 U·mL-1蛋白酶K，在室温下孵育15 min后灭活蛋白酶K，取样品裂解液2 μL直接用作荧光RT-LAMP反应的模板[3].用于SARS-CoV-2裂解缓冲液还有其他配方，对比热裂解病毒，该法可有效地破坏病毒以释放RNA，同时使未纯化样本中存在的核酸酶失活，但裂解缓冲液处理样品会稀释样品而导致LAMP检测灵敏度降低[56].Kundrod等[13]优化裂解病毒方法，通过TCEP/EDTA裂解缓冲液处理和热裂解病毒相结合，并得出结论：增加缓冲液浓度会使裂解效率显著提高，5×浓度达到最完全的裂解，并且加入200 mmol·L-1盐酸胍会导致更完全的核糖核酸酶失活.对于鼻咽、鼻拭子洗脱液和唾液样本都具有临床意义，三重检测方法的最低检测限可达20～23 copies/反应.

鼻咽拭子样本采集过程令人不适，操作需要专业人员，并容易感染测试人员；唾液检测具有操作简单、侵入性小和感染风险低等优点，但是唾液的粘性以及蛋白水解酶的存在使得唾液样本的直接应用具有一定困难.Duan等[58]为了检测人体呼气中的SARS-CoV-2 RNA，研制了一种在样本采集现场将RNA逆转录为DNA的手持呼气测定仪Bubbler，可以直接对呼气中的气雾化颗粒进行采样.Daniels等[59]研制了一种收集呼气冷凝液(EBC)的口罩，对EBC口罩样本进行RT-PCR检测，结果与鼻咽拭子样一致.患者呼出的EBC可能是诊断SARS-CoV-2的一种重要的替代样本类型.虽然呼气中的病毒RNA更丰富，但病毒载量比鼻咽拭子中的病毒载量低几个数量级，因此还是受到一定限制，目前还没有应用于LAMP扩增，仍需要进一步研究[58].

4.2 检测智能化与潮流化

将智能手机、平板电脑转变为临床POC诊断工具已被许多检测模式所证明，Heithoff等[60]调查了一种基于智能手机的实时LAMP(SMART-LAMP)的技术测试，以了解它是否具备POC检测的速度、灵敏度、低成本、可扩展性和可访问性的组合属性.Papadakis等[61]报道了一种便携式的实时定量比色LAMP(qcLAMP)装置，比色法检测依赖于肉眼对颜色变化的评估很难辨别，利用智能手机相机结合算法或辐射成像获得更准确和定量比色检测SARS-CoV-2的结果.Rohaim等[62]为了进一步提高分析性能并消除操作员分析结果的主观性，设计了一种新型手持式智能诊断仪，配备了自动图像采集和处理算法，并通过人工智能(AI)管道对整理的数据进行处理，这种先进的人工智能算法实现的LAMP(AI-LAMP)针对SARS-CoV-2的RdRp基因显示了很高的分析灵敏度和特异性.将物联网、机器学习工具和大数据分析等应用于新冠肺炎诊断，可以快速准确地得出结果[63].

5 总结与展望

快速检测战略是防治和管理未来潜在流行病的关键[64].快速、特异性强、灵敏度高的LAMP扩增检测平台具有广阔的应用前景.例如，微流控芯片技术把样品前处理、LAMP扩增、检测集成于芯片中，将生物传感器的超高灵敏度与人工智能和物联网的进步相结合的LAMP检测方法有助于更好地控制潜在的疾病传播[64]，实现了样品到检测结果的可视化监测.因此，未来LAMP 的应用研究主要往集成式、便携式、操作简便、高通量、低成本、易判读、人工智能的方向发展，为病毒检测的快速化、现场化、可视化提供更多的手段.