响应面法优化甘青虎耳草总黄酮的提取及抗肿瘤活性研究

薛志红，杨春燕，余 阳

(1.安徽新华学院 药学院，安徽 合肥 230088；2.昆明植物研究所，云南 昆明 650204)

甘青虎耳草(SaxifragatanguticaEngl.)作为一种经典藏药，为多年生草本植物，高约3～30 cm，在甘肃、青海、四川以及西藏等地广泛分布，全草入药，性凉味苦，对风热退烧、倾泻肝胆以及咳嗽，炎症等方面有一定的治疗作用。[1]有研究表明，甘青虎耳草中含有丰富的黄酮等化学成分，在抑菌、抗炎、抗病毒以及抗肿瘤方面具有显著效果。[2-4]亦有研究报道，甘青虎耳草能够有效抑制人的胃癌细胞生长，促进胃癌细胞的凋亡，在抑制甲状腺瘤的抑制方面，效果也非常显著。[5-6]当前甘青虎耳草总黄酮化合物在抗癌、抗病毒等活性方面，现已成为广大医药工作者研究的重点。

本文通过响应面分析方法，对甘青虎耳草的黄酮提取方法进行优化，同时对其所含总黄酮进行抗肿瘤实验，旨在发现有抗肿瘤活性的成分，为甘青虎耳草的研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料与试剂

甘青虎耳草(干燥，全株购买自亳州药材市场)、芦丁(北京索莱宝科技有限公司，批号：10082-2020707)、乙醇(分析纯，上海国药集团化学试剂有限公司)。环磷酰胺(CTX，北京华迈科生物技术有限责任公司)，荷瘤小鼠(BALB/c，4T1(小鼠乳腺癌细胞)25只，MCF-7(人非小细胞肺癌细胞)25只，小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.1.2 实验仪器

电子天平(型号：Sartorius BT；厂家：济南欧莱博科学仪器有限公司)、离心机(型号：GT10-1；厂家：江苏大周过滤科技有限公司)、紫外分光光度计(型号：UV-9000；厂家：上海元析仪器有限公司)、BK型超声波萃取器(巴克超声波科技有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 黄酮提取工艺

将干燥的甘青虎耳草经过粉碎(100目)之后，使用超声波萃取器进行提取，随后使用离心机进行离心(4000 r/min)，将烧瓶中的上清液定容，通过紫外分光光度计测其吸光度，计算甘青虎耳草总黄酮的提取收率。

1.2.2 黄酮含量测定

(1)标准曲线绘制

精确称取干燥(120℃)至恒重的芦丁(10 mg)作为对照品，将其置于100 mL的容量瓶中定容(75%乙醇，0.1g/L)。同时分别精密量取0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL定容的对照品，分别置于容量瓶中，摇匀放置10 min，参照赵杨[7]等方法得回归方程：y = 12.54 x-0.34(r = 0.9998)。

(2)甘青虎耳草总黄酮的含量测定

精确称量干燥的甘青虎耳草样品放置100mL的烧瓶种，加入75%的乙醇，加热回流、抽滤，收集滤液，用75%的乙醇将其定容至50mL，得到总黄酮提取液。量取1.0 mL的甘青虎耳草总黄酮提取液，通过上述方法得样品溶液待测，得样品吸光度，最终算出总黄酮的质量浓度，计算含量，公式如下。

Y =(c* n*V / m)*100%

式中：Y：纵坐标；c：总黄酮质量浓度；m：干燥的甘青虎耳草质量；n：稀释倍数；V：样品体积

1.2.3 单因素实验

以总黄酮提取率为考察指标，乙醇作为提取溶剂，按上述提取过程，分别对提取时间、液料比、超声波功率进行单因素实验。提取时间设置5个水平(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)；液料比设置5个水平(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)；超声功率设置5个水平(30 W、60 W、120 W、240 W、360 W)

1.2.4 响应面实验

在单因素实验的基础上，采用Design expert 软件的Box-Benhnken设计响应面实验，将甘青虎耳草总黄酮提取的三因素确定为提取时间(A)、液料比(B)、超声波功率(C)，同时以甘青虎耳草总黄酮百分含量(Y)为目标，具体的实验因素水平编码详见表1。

表1 因素与水平设计表

1.2.5 甘青虎耳草总黄酮的制备

按照上述甘青虎耳草总黄酮优化后的提取方法，进行总黄酮提取，最后得到棕黄色的甘青虎耳草总黄酮。通过芦丁作为对照品，用硝酸铝法测得甘青虎耳草总黄酮的纯度为86.34%。

1.2.6 甘青虎耳草总黄酮急性毒性实验[5]

通过霍恩氏法进行甘青虎耳草总黄酮的急性毒性实验，采取1.0 g/kg的剂量对实验小鼠灌胃，进行预实验，观察小鼠在24 h内的生命活动状况(小鼠进食、饮水、活动、背毛、体重、精神状态、存活动物数、死亡等)，为发现小鼠出现任何不良症状，也没有中毒以及死亡出现。实验采用1.0、2.0、4.0、10.0 g/kg的剂量进行急性毒性实验，通过24 h对小鼠进行3次灌胃，观察2周。

1.2.7 甘青虎耳草总黄酮的体内抗肿瘤实验

荷瘤小鼠(BALB/c，4T1(小鼠乳腺癌细胞))25只以及MCF-7(人非小细胞肺癌细胞)25只，分别精确称其质量，随机分为5组：甘青虎耳草总黄酮低剂量组(灌胃给药50 mg/kg，每日一次)、中剂量组(灌胃给药100 mg/kg，每日一次)、高剂量组(灌胃给药200 mg/kg，每日一次)、CTX组(环磷酰胺，腹腔注射，20 mg/kg，隔日一次)及空白对照组(灌胃等体积生理盐水)，用药剂量大小参照周敏等实验方法。[8]连续给药10天，断颈处死小鼠，分离肿瘤，称其肿瘤质量。通过公式：抑瘤率(%)=(C-T)/ C×100%，其中，C为对照组的平均肿瘤质量，T为给药组的平均肿瘤质量。

1.2.8 数据处理

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 提取时间对甘青虎耳草总黄酮含量的影响

将甘青虎耳草提取的温度、液料比保持不变，分别考察其提取时间(30 min、60 min、90 min、120 min、150 min)对总黄酮含量的影响，实验结果见图1(A)。随着甘青虎耳草提取时间的增加，甘青虎耳草总黄酮的含量出现先增加随后降低的现象，在120 min时，达到含量的峰值。对其原因分析可能是：a.在随着时间延长，总黄酮发生了降解反应，使得其含量降低；b.随着提取时间延长时，提取物中的杂质含量也同时增加，导致甘青虎耳草总黄酮的总含量降低。

2.1.2 液料比对甘青虎耳草总黄酮含量的影响

将甘青虎耳草提取时间、提取温度保持不变，考察液料比(10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1)对甘青虎耳草总黄酮含量的影响，具体实验结果见图1(B)。随着甘青虎耳草液料比的增加，总黄酮含量也随之逐渐增大，实验发现当液料比在40∶1时，达到最大值，继续增加溶剂的量，总黄酮的含量没有明显变化，最终确定其提取的液料比为40∶1。

2.1.3 超声波功率对甘青虎耳草总黄酮含量影响

将甘青虎耳草液料比、提取时间保持不变，分别考察提取时超声波功率(30 W、60 W、120 W、240 W、360 W)对甘青虎耳草总黄酮含量的影响，实验结果见图1(C)。实验发现，随着超声功率不断增加，甘青虎耳草总黄酮含量也明显升高，但是当提取功率达到240 W时，提取的效率出现显著下降。其原因可能是较高的提取功率使得其黄酮类成分被破坏分解。[8]

图1 各单因素实验对甘青虎耳草总黄酮的影响

2.2 响应面分析法优化提取工艺

2.2.1 回归模型的建立及结果分析

依据Box-Benhnken方法，经过单因素实验后，将甘青虎耳草提取时间、液料比、超声波功率作为自变量，甘青虎耳草总黄酮的收率作为应变量(响应值)，实施三因素三水平进行响应面实验分析。最终得到优化实验组(17组)，实验数据见表2。同时，多元回归拟合结果见表3。

表2 实验设计及结果

编号编码水平A提取时间(min)B液料比(g.g-1)C超声功率(W)甘青虎耳草总黄酮收率(mg/g)800139.05900-141.2110-1-1-140.231100041.221211038.211301-140.1214-10-141.221500041.0916-11040.661701139.02

表3 回归分析结果

经Design-Expert 8.0.6对实验数据进行回归拟合，最终得甘青虎耳草总黄酮的(Y)对实验因素的回归方程：Y(总黄酮百分含量)=41.28+0.10 A+0.24 B+0.053 C-0.41 AB+0.09 AC-0.11 BC-1.44 A2-0.69 B2-6.0 C2。上式中，在实验设计上，对提取时间、液料比及超声波功率，均通过编码处理，式中各相关因素系数的绝对值大小，反应了各个单因素对响应值的影响，同时系数的正负反映了各因素对响应值的正负影响关系。[10]

通过表3，A、B、C的二次项可知，提取时间与液料比及提取时间与超声功率的交互项(P<0.0001)，表明分别对甘青虎耳草总黄酮的提取工艺影响成显著。

2.2.2 响应面结果分析

依据回归分析结果显示，分别作出响应面图，如图4所示，I、II、III三组图直观的反映了提取时间、液料比及超声功率3个单因素之间的相互作用对总黄酮含量响应值的影响程度。[11]其中，等高线的形状也在一定程度上反映交互效应的强弱程度。[12]

响应面图是响应值Y对应与A、B、C三实验因素组成的三维空间曲面图以及在二维平面上的等高线图，其Y数值能够非常直观的对A、B、C三实验因素及两者之间的交互作用的影响。其中，等高线的形状在一定程度上对应其交互效应的强弱情况，椭圆形状显示出相关因素之间的交互作用明显，但圆形则表现出交互作用不显著。

依据表3的回归分析中的P值情况，通过图2(I)可以看出，液料比与提取时间之间的交互作用呈极显著水平，等高线呈椭圆形状。同时，当超声功率一定时，随液料比与提取时间之间的上升，甘青虎耳草总黄酮的提取得率，表现出先迅速上升后缓慢下降的趋势，在一定程度上说明两者交互因素能够对总黄酮的提取效果产生显著影响，液料比在40∶1附近数值对提取收率有显著影响。通过图2(II)显示，提取因素中的超声功率与提取时间交互作用，表现为显著水平，等高线呈椭圆形。当液料比为一固定值时，若超声功率与提取时间不断增加，甘青虎耳草总黄酮的提取率表现出先缓慢上升随后出现逐渐降低的趋势，显示提取的超声功率与提取时间存在较小波动，对总黄酮的提取率产生的影响较小。通过图2(III)可知，甘青虎耳草提取的超声功率与提取液料比之间的交互作用，为显著水平，等高线表现出椭圆形，在提取时间固定时，随着超声功率与液料比因素数值上升，总黄酮含量表现出先显著升高，随后快速下降的趋势，超声功率在160W之后，对甘青虎耳草总黄酮的提取收率有较大影响。

图2

2.2.3 验证性实验

通过对实验模型进行分析，甘青虎耳草总黄酮提取工艺参数为：超声时间为120 min；液料比为40∶1；超声功率为240 W，同时，在此实验条件下对甘青虎耳草总黄酮进行提取，理论收率为43.2 mg/g，依据此实验条件进行多次平行验证性实验，得到收率为42.6 mg/g，与理论预测值对比，RSD < 5%，相对误差值较小。

2.2.4 急毒性实验结果与分析

急毒性实验结果表明，实验小鼠生命体征良好，无中毒及死亡现象发生。具体数值详见表4所示。

表4 甘青虎耳草急毒性实验结果

2.2.5 荷瘤小鼠肿瘤的抑制效果与分析

通过表5结果可以看出，甘青虎耳草总黄酮给药后，荷瘤小鼠肿瘤(MCF-7)各组小鼠的体质量正常，CTX组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组分别对照组相比，没有统计学差异(P>0.05)，其中，高剂量组的终止体质量与对照组终止体质量相比，具有统计学差异(P<0.05)，高剂量组的瘤质量与对照组瘤质量相比，具有统计学差异(P<0.05)。

表5 甘青虎耳草总黄酮对荷瘤小鼠肿瘤(MCF-7)的抑制效果

通过表6结果可以看出，甘青虎耳草总黄酮给药后，荷瘤小鼠肿瘤(4T1)各组小鼠的体质量正常，CTX组、低剂量组、中剂量组以及高剂量组分别对照组相比，没有统计学差异(P>0.05)，其中，高剂量组的终止体质量与对照组终止体质量相比，具有统计学差异(*P<0.05)，高剂量组的瘤质量与对照组瘤质量相比，具有统计学差异(#P<0.05)。

表6 甘青虎耳草总黄酮对荷瘤小鼠肿瘤(4T1)的抑制效果

2.2.5 荷瘤小鼠给药后肿瘤大小对比分析

荷瘤小鼠(MCF-7、4T1)连续给药10天后，断颈处死小鼠，分离肿瘤，甘青虎耳草总黄酮高剂量组、CTX组与对照组对比，效果显著，详见图3所示。

图3 荷瘤小鼠(MCF-7、4T1)给药后代表性肿瘤图像

3 讨论

近年来，关于甘青虎耳草化学成分的研究报道较多，特别是作为主要药用成分之一的总黄酮，由于具有较好的抗炎、抗肿瘤等作用，也越来越受到关注。[13-14]

本实验通过Box-Behnken实验设计及响应面具体分析，建立了甘青虎耳草总黄酮数学模型，对比了提取时间、液料比及超声功率三个单因素对甘青虎耳草总黄酮收率的相关影响，通过单因素、响应面实验，最终得出甘青虎耳草总黄酮的最佳提取工艺为：超声时间、超声功率、液料比分别为120 min、240 W及40∶1(g.g-1)，理论收率为43.2 mg/g，依据此实验条件，最终验证性实验得到收率为42.6 mg/g，与预测值有较好的相符性。

本实验有效避免了传统提取方法中较高温度对总黄酮成分的破坏作用。同时，实验通过对荷瘤小鼠的体内抑瘤实验，对甘青虎耳草生物活性物质的抗肿瘤作用进行分析研究，发现甘青虎耳草总黄酮有较好的抗肿瘤活性，为抗肿瘤药物的完善，提供一定的参考价值，同时为甘青虎耳草资源的综合利用提供参考依据。