高糖对滑膜间充质干细胞衰老的影响

谭淑仪 刘宇薇 高海

1南方医科大学口腔医院盘福院区种植修复科（广州 510180）；2南方医科大学口腔医院修复科（广州 510280）；3南方医科大学口腔医院盘福院区（广州 510180）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是世界上第四大致残原因，主要病理特征为关节软骨损伤和软骨下骨硬化，包括软骨退化、骨重塑、骨赘形成和滑膜炎症［1-2］。2 型糖尿病患者骨关节炎的发病率为54%［3］，糖尿病预示着骨关节炎的预后不良［4］。研究表明，糖尿病所引起的炎症反应和高糖环境促进了关节软骨的破坏［5］，其发病机制尚未明确。

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有自我更新、向软骨分化和免疫调节的潜能，干细胞治疗作为骨关节炎的一种再生细胞治疗方法，是一种治疗OA 的新策略［6-7］。MSCs 来源于骨髓、脂肪组织、骨骼肌、胎盘、脐带、牙髓和滑膜等多种组织［8］。其中，取自滑膜组织的间充质干细胞（synovial mesenchymal stem cells，SMSCs）向软骨细胞分化及增殖的潜能更大，与其他来源的间充质细胞相比，SMSCs 具有优越的软骨原性［9］，因而，SMSCs 在软骨损伤修复中具有诸多优越性，在OA的治疗中有重要的应用前景。

骨关节炎是糖尿病患者的常见并发症。有研究发现，高糖环境下，滑膜SMCs 的软骨分化能力比低糖培养条件下减弱［10］，但具体机制尚未阐明。干细胞衰老将对细胞功能产生影响，不仅可以导致炎症微环境的产生，并对关节软骨产生不利影响［6］。因此，本研究拟通过探究高糖对滑膜细胞衰老和生物学功能的影响，为SMSCs应用于糖尿病患者骨关节炎的治疗提供风险评估依据。

细胞衰老的主要特点是细胞形态改变，细胞内衰老相关β-半乳糖苷酶含量升高，炎症因子、趋化因子和基质金属蛋白酶类等衰老相关分泌表型SASP 表达上调，以及线粒体的分裂改变［11］。上述指标的改变与细胞进入衰老状态有关，影响细胞的生物学功能，进一步影响体内微环境以及OA 的预后和转归。

1 材料与方法

1.1 主要材料大鼠滑膜间充质干细胞（赛百慷，中国）；细胞衰老半乳糖苷酶染色试剂盒（碧云天，中国）；CCK-8 细胞增殖活性检测试剂盒（广州晶欣，中国）；Mito-Tracker Red CMXRos 线粒体红色荧光探针（碧云天，中国）；ELISA 试剂盒（武汉华美，中国）；Maxima TMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix（2X）（Thermo Fisher Scientific，美国）；总RNA提取试剂盒（Promega，中国）；反转录试剂盒（Thermo Fisher Scientific，美国）；总蛋白提取试剂及BCA-100 蛋白定量分析试剂盒（上海博彩生物科技有限公司，中国）；P21（CPA4956）兔（Cohesion Biosciences，英国）；HRP 羊抗小鼠IgG（BA1050）及HRP 羊抗兔IgG（BA1054）（武汉博士德，中国）。本研究伦理审查编号：粤口医伦审【2021】12 号。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组收到大鼠SMSCs 后，带培养瓶放置在37 ℃，体积分数为5%CO2培养箱中，2 h 后更换新的完全培养基，继续培养24 h。完全培养基采用赛百慷配套原代间充质干细胞培养体系，由88%基础培养基+10%胎牛血清+1%双抗+1%细胞添加剂组成。待细胞融合率达80%～90%，胰酶消化1∶2进行传代。实验分组：高糖组：采用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培养基；对照组：采用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培养基。

1.2.2 CCK-8 检测细胞增殖活性将大鼠SMSCs P4 以每孔5 000 个细胞接种于96 孔板，设5 组复孔，24 h 待细胞完全贴壁后，高糖组换液使用含25 mmol/L葡萄糖的完全培养基，对照组换液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，于24 h，每孔加入10 μL 的CCK 溶液，将孔板置于培养箱中孵育2 h，测定450 nm吸光度，使用酶标仪得到各组OD值。

1.2.3 细胞衰老β-半乳糖苷酶SA-β-gal 染色将大鼠SMSCs P4 以每孔2.9 万个细胞接种于24 孔板，24 h 待细胞完全贴壁后，高糖组换液使用含25 mmol/L葡萄糖的完全培养基，对照组换液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，培养24 h 后吸除细胞培养液，PBS 洗涤1 次，加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。吸除细胞固定液，用PBS 洗涤细胞3 次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入1 mL 染色工作液。37 ℃孵育过夜，光学显微镜下观察并拍照。

1.2.4 实时荧光定量PCR 检测（Real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）将大鼠SMSCs P4 接种于培养瓶中，24 h 待细胞完全贴壁后，高糖组换液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，对照组换液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，于24 h 收集各组细胞，提取总RNA，分光光度计检测RNA 浓度和纯度后逆转录为cDNA，使用特异性引物序列对基因进行聚合酶链反应扩增。使用ABI Step One QPCR 系统，设置反应条件，对各组mRNA 表达量进行分析。

1.2.5 Mito-tracter 染色将大鼠SMSCs P4 接种于共聚焦皿中，过夜待细胞完全贴壁后，高糖组换液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，对照组换液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，培养24 h，PBS 洗一遍，加入配制好的Mito-Tracter 培养基，放回37 ℃温箱中，30 min 后取出，更换培养基，激光共聚焦显微镜镜下观察并拍照。

1.2.6 Western blot 检测将大鼠SMSCs P4 接种于培养瓶中，24 h 待细胞完全贴壁后，高糖组换液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，对照组换液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，于24 h收集各组细胞，RIPA 裂解液提取总蛋白，BCA 法检测蛋白浓度。蛋白上样后进行电泳分离蛋白，结束后转移至聚偏氟乙烯膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，孵育一抗和二抗，化学发光显影及定影后，拍照。Western blotting 结束后，使用SensiAnsys 分析各蛋白条带的灰度值。

1.2.7 酶联免疫吸附法（ELISA）检测将大鼠SMSCs P4 接种于培养瓶中，24 h 待细胞完全贴壁后，高糖组换液使用含25 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，对照组换液使用含5.5 mmol/L 葡萄糖的完全培养基，于24 h 收集各组上清液200 μL，离心后分装，按照试剂盒说明书要求，检测上清液中透明质酸（hyaluronic acid，HA）的含量，使用酶标仪得到各处理组OD值。

1.3 统计学方法所有统计均使用SPSS 23.0 软件进行分析。实验数据采用均数±标准差表示，CCK-8、PCR 及Western blot 结果采用单因素方差分析比较对照组和高糖组之间的差异，ELISA 结果进行配对T检验。P＜0.05时差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖促进大鼠SMCSs 增殖CCK-8 结果显示，在24 h，两组的SMCSs 增殖活性之间的差异无统计学意义（P=0.675），提示在本实验条件下，24 h 时间点，高糖环境不影响SMCSs 的增殖活性（图1）。

图1 细胞增殖活性Fig.1 Cell proliferative activity

2.2 高糖增加大鼠SMSCs β-半乳糖苷酶表达衰老相关β-半乳糖苷酶是应用最广泛的细胞衰老标志物，利用β-半乳糖苷酶染色检测高糖对SMCSs β-半乳糖苷酶阳性细胞的影响。结果显示，培养24 h，与对照组相比，高糖导致SMCSs β-半乳糖苷酶阳性细胞增多，表明高糖促进SMCSs 细胞衰老。见图2。

图2 β-半乳糖苷酶染色（倒置显微镜，×100）Fig.2 The SA-β-Gal staining（inverted microscope，×100）

2.3 高糖增加大鼠SMSCs SASP 衰老相关因子表达qRT-PCR 结果显示，培养24 h 后，高糖组衰老相关因子SASP 的mRNA 表达较对照组增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。统计学结果为MMP13（P=0.011），TNF、IL-6、INFβ（P=0.000），CXCL1（P=0.003）。如图所示，高糖组MMP13、TNF、IL-6、CXCL1、INFβ 的mRNA 表达均较对照组高，提示高糖促进SMCSs 进入衰老状态。见图3。

图3 MMP13、TNF、IL-6、CXCL1、INF-β mRNA 相对表达量Fig.3 The mRNA expression of MMP13，TNF，IL-6，CXCL1 and INF-β

2.4 高糖促进大鼠SMSCs 线粒体裂解培养24 h后，行Mito-tracter 染色，40 倍显微镜下观察，高糖组较对照组细胞中线粒体碎片化显著增加（图4），高糖促进了大鼠SMSCs 线粒体的裂解。

图4 Mito-tracter 染色（激光共聚焦显微镜，×40）Fig.4 Mito-tracter staining（laser scanning confocal microscope，×40）

2.5 高糖抑制大鼠SMSCs p21蛋白表达Western blotting 结果显示，培养24 h 后，高糖组衰老相关蛋白p21 表达下降，方差分析显示与对照组相比差异有统计学意义（P=0.00），表明高糖培养条件抑制了大鼠滑膜间充质干细胞的p21 蛋白表达（图5）。

图5 p21 蛋白表达量Fig.5 The protein expression of p21

2.6 高糖抑制大鼠SMSCs 透明质酸分泌ELISA结果培养24 h 后，与对照组相比，高糖组透明质酸分泌被明显抑制，采用配对t检验进行数据统计，结果显示差异有统计学意义（P=0.002），表明高糖培养条件抑制了大鼠滑膜间充质干细胞的透明质酸分泌。见图6。

图6 透明质酸浓度Fig.6 The concentration of HA

3 讨论

本实验结果显示，高糖刺激下，大鼠SMSCs SAβ-gal 染色阳性细胞增加，胞内线粒体呈碎片化，衰老相关分泌表型SASP 表达增加，p21 表达及透明质酸分泌降低。以上结果表明，高糖导致大鼠SMSCs 进入衰老状态，破坏了细胞的生物学功能，将进一步影响体内微环境，导致糖尿病OA 患者的预后和转归产生不确定性。

SMSCs 本身的增殖功能下降和衰老，将导致其自我更新潜能弱化。研究表明，高糖可以促进多种细胞的增殖，对于干细胞而言，则未必。高糖（25 mmol/L）可以促进端粒酶永生化的间充质干细胞的增殖，其凋亡不受高糖环境影响，而对髓核来源的间充质干细胞，25 mmol/L 的高糖培养3 d 并不会影响其增殖和迁移能力，而在对数生长期，干细胞增殖受到高糖抑制［12］。本研究中CCK-8 结果显示高糖条件下本应受到促进的增殖并未发生，表明高糖使SMSCs 本身的增殖功能下降。β-半乳糖苷酶的活性升高是鉴定细胞衰老的金标准［13］，高糖组SMSCs 的SA-β-gal 阳性细胞多于对照组，提示衰老SMSCs 可能在高血糖状态下增加或积累。此时衰老SMSCs 的增加或积累，并非一过性，p21（全称p21Waf/Cip1）是一个重要的细胞周期阻滞因子，其主要功能是阻滞细胞周期在G1/S 期，当p21 功能缺失时，就可能使损伤的细胞强行进入细胞周期，走向衰老和凋亡［14］。本研究中，高糖刺激下SMCSs 的p21 表达下调，表明此时细胞受到损伤，且因p21 表达下调而无法修复损伤，加速细胞进入衰老状态。SMSCs 作为治疗OA 的潜力细胞，其自我更新能力尤为重要，而SMSCs 增殖功能下降和衰老，将导致该潜能弱化。

线粒体与干细胞特性的维持和干细胞分化成特定的细胞类型有关，线粒体的动力学（融合和裂变）失衡将导致干细胞衰老并影响干细胞的功能。本实验中，Mito-tracter 染色，高糖组细胞线粒体碎片化明显增加。线粒体裂变的增加，可以扩大与氧气的接触面积，实现更多的产能，但是也会增加酸的产生，增加产热，不利于细胞生长，影响细胞功能［15］。当线粒体损伤或未折叠蛋白在线粒体中积累时，线粒体裂变增加，以稀释或分离受损蛋白，以便进一步降解，同时，通过线粒体自噬清除线粒体可能有助于处理受损的蛋白质。高糖条件下，线粒体的裂变增加，可能是线粒体自噬功能受损导致，具体机制仍需进一步探讨。

SASP 是干细胞衰老相关的重要标志，包括各种细胞因子、趋化因子、细胞外基质蛋白和生长因子，SASP 的表达上调，从多层面影响了SMSCs 的生物学功能，抑制了SMSCs 的成软骨分化，并加重炎症，破坏软骨基质。IL-6 被认为是与OA 相关的重要炎症因子，在OA 患者的滑膜液中IL-6 表达上调，与MMPs 呈正相关［16］。此外，研究发现IL-6 阻碍了滑膜液中的MSCs 向软骨分化，从而降低了干细胞为基础的颞下颌关节性骨关节炎治疗的有效性［17］。干扰素（IFN）作为一种细胞因子亚群，可调节骨基质的动态平衡，与MMPs 的表达相关。MMP13 在骨关节炎中的上调，导致软骨关键结构蛋白Ⅱ型胶原降解、基质破坏和炎症，已有研究发现MMP13 沉默减少了关节软骨退化/纤颤、半月板恶化、滑膜增生、骨赘和促炎基因表达［18］。TNF-α可诱导IL-6 的产生［19］。趋化因子在糖尿病性骨关节炎的发生发展中发挥重要作用，在部分由趋化因子驱动的进行性滑膜炎中，滑膜分泌大量代谢废物，进而进一步加重炎症［20］。在本研究中，高糖环境下，TNF-α、IL-6、CXCL1 表达均上调，提示高糖可能通过激活NF-κB 信号通路导致细胞衰老及功能受损，而SASP 表达上调涉及多条信号通路，提示该病程并非单一通路激活的结果，具体机制需进一步研究。

透明质酸来源于滑膜细胞及滑膜间充质干细胞，在滑膜液的减震、润滑和粘弹性方面起着重要作用。当骨性关节炎发生时，透明质酸HA 解聚，相对于正常情况，分子量降低，清除更快，导致滑膜液粘弹性受损［21］。研究发现，在骨性关节炎患者的关节腔内注射透明质酸，能有效减弱炎症反应，诱导细胞的软骨向分化［22］。因此，高糖环境下，SMCSs 分泌HA 减少，并由于SMCSs 的衰老，导致滑膜细胞生成减少，进一步间接降低了HA 的分泌，不利于OA 的治疗。

以上结果表明，将SMSCs 应用于糖尿病OA 患者治疗，将存在以下风险：高糖导致SMSCs 进入衰老状态，其增殖功能受损，将导致自我更新潜能弱化，同时，SMSCs 衰老及生物学功能的破坏，使SMSCs 的成软骨分化能力及关节修复能力下降，导致糖尿病OA 患者的预后和转归产生不确定性。