基于生物信息学分析早期糖尿病肾病发病机制

李英娜 董兰 刘婉珊 全林菲 何凤

广州市第一人民医院肾内科（广州 510180）

糖尿病（diabetic mellitus，DM）是一种累及全身多个器官、具有高致残率和致死率，严重危害公众健康的慢性代谢性疾病。我国已是糖尿病第一大国，而糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病主要的慢性微血管并发症之一，是目前全球终末期肾脏病（ESRD）的主要原因之一，目前已成为我国需迫切解决的慢性疾病问题之一［1-3］。然而，目前的临床治疗措施有限，不能有效阻止糖尿病肾病向ESRD 进展。ESRD 患者大多需终身替代治疗，高昂的费用与无明显改善的预后，使之成为我国医疗系统、患者及其家属的巨大负担。糖尿病肾病的发病机制极为复杂，目前较多研究表明其病程的发生发展主要与血流动力学异常和糖脂代谢紊乱等过程有关，但其具体机制仍待进一步阐明［4］。越来越多的流行病学和临床前研究表明［5］，炎症反应在糖尿病肾病的发病机制上占有重要的地位，其可能是发病初期最先参与的过程，然而其具体的发病机制尚未完全阐明。因此，以炎症为靶标去探寻糖尿病肾病诊断和治疗的新视野是目前研究的一大热点，同时对糖尿病肾病早期潜在的致病分子和治疗靶点亦是亟待挖掘。

基因表达综合库（gene expression omnibus，GEO）创建于2000年，是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）创建并维护的基因表达数据库，是目前最大的公共基因资源库，其中海纳了高通量基因表达数据，具有全面的生物学资料且获取方式简单易操作。测序技术为生物科学研究带来了新思路，随着生物信息学的提出及发展，生物信息学工具收集、储存、整合、分析这些海量的数据，为探寻更加深刻的分子机制提供可能性，更有利于深入探索疾病进展中的分子变化和相关信号通路的功能联系。本研究拟利用生物信息学方法，分析并挖掘早期糖尿病肾病发生和发展的重要信号通路及分子，为进一步阐明糖尿病肾病的发病机制以及靶向分子治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1 标本来源收集2019年1月至2021年1月收治于广州市第一人民医院肾内科首次入院并经肾脏组织病理活检确诊的DN 患者6 例（eDN 组），诊断符合糖尿病肾脏疾病临床诊疗中国指南（2021版）［6］。对照组（NC 组，6 例）样本为肿瘤切除术后癌旁正常组织。本项研究经广州市第一人民医院伦理委员会批准，获得所有参与者/患者的知情同意书。手术获取标本组织后立即放置于冻存管中，随后转入液氮，最后放于-80 ℃冰箱储存备用。

1.2 仪器与试剂包括常温/4 ℃离心机（Thermo，Eppendorf）；Nanodrop 2000 分光光度计（Thermo Scientific）；普通PCR（ABI）；实时荧光定量PCR 仪（Roche）；Trizol 提取液（Sigma）；逆转录试剂盒（HiScript Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit，Vazyme）；SYBR®Premix Ex TaqTM（SYBR Green，Vazyme）；焦碳酸二乙酯（DEPC，Sigma）；免疫组化试剂盒（Bioss IHC001）；石蜡切片机（Leica HistoCore MULTICUT）；载玻片；盖玻片；中性树脂；明场正置显微镜（Lecia DM2500）。

1.3 数据集获取及差异基因的筛选在NCBI 的基因表达综合（GEO）数据库中下载RNA 测序谱GSE142025 数据集，应用R 语言对其进行基因表达分析。该数据集中包含NC组（6例）与eDN组（6例）的基因表达数据。基于R 软件中“limma”包可视化NC 组与eDN 组之间的差异表达基因（DEGs），以P＜0.05 和|log2FC|＞1 为DEGs 的筛选标准。使用R 版本4.0.3 对GEO 数据集进行分析。

1.4 生物信息学分析使用R 语言中“pheatmap”“ggplot2”“tidyverse”等软件包，通过heatmap 和volcano 将DEGs 中显著的差异基因展示出来。

采用基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）方法，利用R 软件分析差异表达基因数据，获取eDN 组差异表达基因富集的生物学功能与相关信号通路，设定筛选标准为：归一化富集得分（normalized enrichment score，NES）绝对值＞1、P＜0.05、错误发现率（false discovery rate，FDR）＜0.25。

利用在线工具STRING（https：//cn.string-db.org/），将差异表达基因导入系统，构建PPI 网络。采用Cytoscape3.8.0 软件（http：//www.cytoscape.org）中的cyto Hubba 插件筛选PPI 网络中的Hub 基因。

1.5 基因表达水平检测

1.5.1 免疫组织化学染色（IHC）手术或穿刺所取组织于10%福尔马林固定，进行常规组织脱水、石蜡包埋，4 μm 连续切片，切片放置37 ℃恒温箱过夜。选择合适的切片进行免疫组织化学染色，烤片1 h 后依次进行脱蜡、水化，使用3%H2O2抑制内源性过氧化物酶，用枸橼酸钠缓冲液在微波炉中进行抗原修复，5%BSA 常温封闭1 h，弃去封闭液加入稀释好的一抗，切片置于湿盒中放-20 ℃冰箱过夜。次日孵育二抗，后加入二氦基联苯胺（DAB）显色，显微镜下观察效果，苏木素复染细胞核，脱水透明后中性树脂封片，通风处晾干于明场显微镜下观察拍摄。

1.5.2 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）根据制造商的方案，使用Trizol 提取液（Sigma）分离提取组织标本总RNA，随后在Nanodrop 2000 分光光度计上规范操作，检测所提RNA 的浓度及判定其纯度，并做好记录。按试剂盒说明书操作，经逆转录合成为cDNA，再使用SYBR Green RT-qPCR 检测试剂盒检测目的基因相对表达水平，总反应体系为20 μL，每个样品做三个复孔，以GAPDH 为内源性对照。

1.6 统计学方法使用Microsoft Excel 软件建立资料数据表格，应用SPSS 22.0 进行统计学分析，对所有计量资料呈正态或近似正态分布的以（±s）表示，正态分布且方差齐者采用独立样本t检验；非正态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，采用两独立样本的非参数秩和检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异表达基因的分析在GEO 数据库中检索并下载，获取RNA 测序谱GSE142025 数据集，流程见图1A。通过对数据进行FPKM 标准化，利用R软件分析，发现相比较于NC组，eDN组有1 859个差异表达基因（DEGs），其中有1 063 个表达上调，有796个表达下调。其中，以P＜0.05和|log2FC|＞1为DEGs 的筛选标准。在火山图中显示了NC 组与eDN 组间总的差异表达基因，见图1B。同时，用热图显示了eDN 组中显著表达上调和下调各25 个，见图1C。

图1 NC 组与eDN 组间的差异表达基因Fig.1 Differentially expressed genes between NCgroupand eDNgroup

2.2 KEGG 富集通路分析对筛选出1 859 个差异表达基因进行功能富集，以了解其可能参与的生物过程。使用GSEA 的方式将差异基因富集到KEGG 通路中，利用R 软件来分析NC 组与eDN 组之间的通路富集，筛选标准为：NES 绝对值＞1、P＜0.05、FDR＜0.25，结果见表1。其中，“JAK-STAT通路”、“细胞因子受体通路”、“趋化因子信号通路”、“细胞黏附分子通路”、“细胞外基质受体相互作用通路”等显著上调，见图2。结果显示，显著上调的KEGG 富集通路多与炎症、细胞因子、趋化因子相关，提示CCR2 等显著上调基因可能通过炎症相关通路参与早期糖尿病肾病的发生发展。

图2 eDN 组中上调的KEGG 富集通路Fig.2 Up-regulated KEGG-enriched pathways in the eDN group

表1 KEGG 富集通路结果Tab.1 KEGG enrichment pathway results

2.3 蛋白质相互作用网络的构建使用在线工具STRING 和Cytoscape 构建蛋白互作网络（PPI），PPI中红色为上调基因，蓝色为下调基因，可见CCR2、CCR4 和CXCR3 作为HUB 基因表达显著上调，见图3A，提示CCR2 等HUB 基因可能通过炎症、趋化因子信号通路发挥其作用，继而影响早期糖尿病肾病的发生发展。

2.4 HUB基因水平的验证通过IHC检测HUB基因在早期糖尿病肾病患者组织中的表达，与上述生物信息学分析结果一致，相比于NC 组，CCR2、CCR4 和CXCR3 在早期糖尿病肾病患者中均显著表达，见图3B。同时采用RT-qPCR 对肾组织样本进行检测，CCR2、CCR4 和CXCR3 的相对基因表达在eDN 组较NC 组高表达，而且CCR2 mRNA 较对照组显著上调达2.51 倍（P＜0.05），见表2与图3C，与IHC 结果一致。

图3 eDN 肾组织中上调HUB 基因的鉴定及检测Fig.3 Identification and detection of up-regulated HUB genes in eDN kidney tissue

表2 NC 组与eDN 组中CCR2、CCR4、CXCR3 mRNA 水平的比较Tab.2 Comparison of CCR2，CCR4，CXCR3 mRNA levels in NC group and eDN group

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病常见的累及肾脏的慢性微血管并发症，大约有30%～40%的糖尿病患者会最终发展为糖尿病肾病，其患病率的增加与世界范围内糖尿病患病率的急剧上升平行，且国家收入及发展程度与患病率也有平行的趋势［7-8］。糖尿病肾病是糖尿病患者生活质量和生存时间的独立危险因素，是我国新发慢性肾衰竭的重要病因，是肾脏透析的主要原因之一［9］。已有明确的研究表明糖尿病肾病的发病机制是多因素且较为复杂，主要涉及代谢紊乱、糖基化终产物的堆积、炎症反应、氧化应激、内质网应激和巨自噬/自噬等因素［10-12］。由于其代谢紊乱极为复杂，一旦发展到ESRD，往往比其他肾脏疾病的治疗更加困难，大多需终身替代治疗或者进行肾移植。因此探索糖尿病肾病发病机制相关信号通路和分子对早期防治、延缓糖尿病肾病具有重大意义。

本研究通过生物信息学的方法，筛选和分析eDN 组和NC 组患者之间差异表达基因。eDN 组有1 859个差异表达基因，其中有1 063个表达上调，有796个表达下调。KEGG通路富集显示，“JAK-STAT通路”、“细胞因子受体通路”、“趋化因子信号通路”、“细胞黏附分子通路”、“细胞外基质受体相互作用通路”等炎症相关通路异常激活，与既往研究一致，炎症反应、细胞因子及趋化因子异常表达在糖尿病肾病的发生发展中占据很重要的地位［13］。本研究表明免疫介导的炎症是肾脏损伤的主要潜在机制相符合［14］。

Janus 激酶/信号转导和转录活化因子即JAKSTAT 信号通路是体内重要的信号转导途径，主要由酪氨酸激酶JAK、酪氨酸激酶相关受体以及转录因子STATs 所构成，在机体中可以发挥信号转导和基因转录活化子蛋白的双重作用，是多种细胞因子受体和生长因子主要信号传导的核心［15］。JAK-STAT 信号通路在机体内参与多种生理学过程，其中免疫炎症反应是其主要的作用靶点之一，参与从免疫感染到免疫耐受等免疫过程，该通路异常激活近些年在糖尿病和代谢性疾病方面备受关注［15］。大量研究表明高血糖、糖基化终末产物、炎性物质、多种细胞因子等触发分子可激活JAK-STAT 信号通路，从引起一系列炎症反应，进而参与增殖及纤维化而影响糖尿病肾病的发生发展［16-18］。WANG 等［16］研究发现白芍总苷可产生保护肾脏作用，通过抑制JAK2/STAT3 通路和巨噬细胞增殖能力，从而显著抑制糖尿病肾病进展。慢性糖尿病状态下，糖基化终末产物累积，可上调JAK2/STAT3 信号通路，促进炎症和凋亡，诱导糖尿病肾病的发生［19］。有研究报道［20］，高血糖可调节肾小球系膜细胞中的JAK2 和STAT1、STAT3 和STAT5 活性，并证实高血糖以JAK2-STAT1 依赖性方式刺激肾小球系膜细胞中TGF-β 和纤连蛋白的产生，进而导致糖尿病肾病的发生与发展。另有研究报道［21］，糖基化终末产物可通过受体与其配体相作用激活JAK2/STAT3 通路，诱导小鼠足细胞凋亡，从而加重糖尿病肾病的肾损伤。综上，大量研究阐明JAK-STAT 通路在糖尿病肾病的炎症进展中发挥着重要作用。

趋化因子是一类控制细胞定向聚集和迁移的细胞因子，其功能由趋化因子受体介导，在炎症反应中发挥重要作用。其中有两个主要的趋化因子亚家族：CXC 和CC，一般CXC 趋化因子的成员对中性粒细胞具有趋化性，CC 趋化因子对单核细胞和淋巴细胞亚群具有趋化性［22］。CC 基序趋化因子受体2（CCR2）与MCP-1 结合可有效刺激骨髓中单核细胞的释放，并激活单核细胞和巨噬细胞的迁移和易位，发挥相应的生物学作用［23］。据报道［24］，在人类和实验模型中，MCP-1/CCR2 会导致多种肾脏疾病，包括肾移植慢性排斥反应、狼疮性肾炎、lgA 肾病和糖尿病肾病。在UUO 模型和肾血管性高血压模型中，研究者们使用CCR2 抑制剂或CCR2 敲除阻断MCP-1/CCR2 信号传导已被证明可减轻肾纤维化［25］。KITAGAWA 等［26］发现肾纤维化小鼠模型与相关临床发现一致，证实肾脏CCR2 表达与肾纤维化和巨噬细胞聚集高度相关。MIAO等［27］研究发现CCR2 拮抗作用于局灶节段性肾小球硬化（FSGS）小鼠模型中可使蛋白尿和肾小球损伤显著减少，改善肾功能。另有研究发现［28］，CCR2拮抗剂CCX140-B 在2 型糖尿病和大量白蛋白尿患者中的具有显著降低白蛋白尿的作用，发挥抑制炎症的作用。DU 等［29］研究证实Loganin 可通过糖尿病肾病中MCP-1/CCR2 信号通路抑制巨噬细胞浸润和活化来改善糖尿病肾病的肾损伤。本次研究发现CCR2 作为HUB 基因在早期糖尿病肾病患者的组织中显著上调，KEGG 功能富集集中聚焦于炎症、细胞因子和趋化因子相关通路，提示CCR2 可能作为早期糖尿病肾病发病的潜在靶点，通过JAK-STAT 通路在炎症过程中发挥作用，但其具体作用机制尚不明确，仍需要进一步深入探究。本研究通过在GEO 数据库中检索并获取RNA 测序谱，利用生物信息学方法，筛选和分析eDN 组和对照组之间的差异表达基因并进行KEGG 功能富集，发现CCR2 作为HUB 基因在早期糖尿病肾病的组织中显著上调，提示其可能通过JAK-STAT 通路参与eDN 的炎症过程，但具体的作用机制尚不清楚，由于临床患者的样本量相对有限，后续仍需大量动物和临床试验进行更加深入与精确的验证，其为进一步阐明eDN 发病机制提供新的潜在分子靶点，为糖尿病肾病的治疗提供新的策略和思路。