异秦皮素治疗脑梗死大鼠的疗效观察及机制研究

陈历，季一飞，尹书斌，赵玉萍

(川北医学院第二临床医学院·南充市中心医院神经内科，四川 南充 637000)

异秦皮素(isofraxidin，ISO)是从刺五加提取的一种香豆素类化合物[1]。随着医疗技术的发展，ISO的临床应用越来越多，如在人类癌症[2-4]、炎症疾病[5-6]和氧化应激[7-8]中的抑制作用。Chen等[8]发现，ISO在体内和体外均可抑制NLRP3炎症小体的激活，从而改善心肌梗死预后。然而，ISO在脑梗死中的具体功能及其与NLRP3炎性小体之间的相互作用尚不清楚。因此，本研究拟探讨ISO在脑梗死中的调控机制及其与NLRP3炎性小体的相关性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

32只雄性SD大鼠(220～240 g)购自川北医学院实验动物中心，适应实验环境7 d。本研究的动物实验程序严格按照《实验动物护理使用指南》进行，并经医院伦理委员会批准，伦理批号：NSMC伦理动物审[2021]69号。

1.2 主要试剂及仪器

ISO(武汉远成共创科技有限公司)；活性氧(ROS)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒、IL-10试剂盒、IL-1β试剂盒、IL-18试剂盒、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)抗体试剂盒、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)抗体试剂盒、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体试剂盒(Abcam公司)；SDS-PAGE凝胶制、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(北京索莱宝科技有限公司)。鼠大脑中动脉闭塞模型(MCAO)；栓线(型号：2636-A4TC)；全波长酶标仪(美国，Multiskan)；电子分析天平(LCD-A500)、高速冷冻离心机(德国，Sigma 1-15K)；恒温水浴箱(ZWY-110X50)。

1.3 实验方法

1.3.1 脑梗死大鼠模型及ISO处理 SD大鼠适应实验环境7 d后，分为假手术组(sham组)、MCAO组、ISO 10组(10 mg/kg)和ISO 20组(20 mg/kg)，每组均为8只。ISO组腹腔注射相应剂量的ISO，1次/d；sham组、MCAO组腹腔注射相同体积生理盐水。持续8周。取相应标本做后续的研究。MCAO操作按照Longa等[9]的研究进行：将SD大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，固定于手术台，右侧颈部备皮，作一长约2 cm的纵向切口，钝性分离右侧胸锁乳突肌等肌肉，暴露分离右侧颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉。结扎右侧颈总动脉向心端和颈外动脉根部，动脉夹夹闭颈总动脉远心端，在右侧颈总动脉下方穿一线备用。在分叉处下方约8 mm处作一切口，将线栓插入右侧颈总动脉，收紧备用线，松开动脉夹，当线栓送入约20 mm深时，遇到轻微阻力则轻微回拉1～2 mm，线栓穿过右侧大脑中动脉起始端，将右侧大脑中动脉起始端阻塞，结扎备线，固定线栓，然后迅速记录时间，缝合皮肤，线栓尾端固定在皮肤上。缺血2 h后，小心将线栓抽出，恢复右侧大脑中动脉血供，即形成MCAO模型。sham组大鼠仅给予同样暴露分离颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉操作，但不做结扎和线栓处理。

1.3.2 神经行为评估 再灌注24 h及8周后，由两位对本研究不知情的实验者评估大鼠的神经行为，参照Zea-Longa[9]神经功能障碍评分：5分：不能行走，意识昏迷；4分：原地向左侧旋转；3分：左侧旋转步行；2分：左前肢阻力降低，行走偏左侧；1分：提起鼠尾，左前肢不能完全伸直；0分：无明显神经损伤。将模型组评分为1～4分且无蛛网膜下腔出血的大鼠纳入后续实验，剔除评分为5分的大鼠，并随机补充。

1.3.3 染色分析 用50 mg/kg戊巴比妥钠对大鼠进行麻醉。麻醉成功后将大鼠仰卧位固定于木板上，剪开腹腔，暴露心脏，经左心室灌流，肉眼观察到生理盐水基本无色和肝脏完全变黄后停止冲洗，再以4%多聚甲醛灌注固定，大鼠全身僵硬后断头取出脑组织，用手术刀沿正中裂矢状位把大脑切幵，将右侧大脑半球置于4%多聚甲醛固定液4 ℃下固定24 h，在视交叉后1 mm及5 mm处冠状切面切开，取中间脑组织。置于4%多聚甲醛固定液4 ℃固定24 h，石蜡包埋后，把大脑切片(4 μm厚)用于苏木精-伊红染色法(HE)染色、原位末端转移酶标记技术(TUNEL)染色试验和Nissl染色。

1.3.4 大脑含水量的测量 大鼠麻醉后断头取脑，去除小脑、脑干及嗅球，用手术刀沿正中裂矢状位把大脑切开，将右侧大脑半球用精确度为0.01 mg电子分析天平测量湿重(wet weight，ww)，然后包入锡箔纸放置烤箱中，72 h后称大脑干重(dry weight，dw)，按以下公式计算出大脑含水量[10]，含水量=(ww-dw)÷ww×100%。

1.3.5 氧化应激标志物检测 取新鲜右侧大脑半球，称重后研磨并加入9倍质量的生理盐水制成匀浆液，离心半径6 cm，2 000 rpm离心10 min取上清，采用特异性酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒，对ROS、MDA和SOD的含量进行测定。

1.3.6 ELISA试验 大鼠麻醉后，腹腔注射麻醉，打开腹腔，腹主动脉采血4 mL，注入离心管中待凝固后，4 ℃，离心半径6 cm，3 000 rpm离心10 min，分离血清，-20 ℃保存备用。大鼠采血后，迅速断头冰浴中取脑，取右侧大脑半球，去掉嗅球、小脑和低位脑干等，吸去血迹，用电子天平称重，尽快加入预冷的生理盐水碾磨，制成组织匀浆，4 ℃，离心半径6 cm，3 000 rpm离心15 min，取上清液-20 ℃备用。采用特异性ELISA试剂盒，检测大鼠血清和脑组织中炎性因子(TNF-α、IL-6、IL-10、IL-1β、IL-18)水平。

1.3.7 Western blotting 取新鲜右侧大脑半球，制备匀浆并提取总蛋白，然后用快速金BCA蛋白测定试剂盒测定浓度，用10% SDS-PAGE分离蛋白产物并转移到PVDF膜上。将PVDF膜分别加入NLRP3、ASC和GAPDH的一抗，在4 ℃下孵育过夜，然后分别将二抗在室温下孵育1 h。GAPDH为内参。化学发光法显色，应用凝胶图像处理系统分析目标条带的分子量和净光密度值。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 ISO改善脑梗死大鼠神经功能缺损和脑水肿

脑梗死大鼠各组神经功能评分较sham组升高，差异有统计学意义(P<0.01)。ISO可降低各组脑梗死引起的神经功能评分升高。MCAO组相对sham组评分升高(t=17.15，P<0.01)；ISO 10组的神经功能评分相对MCAO组降低(t=4.50，P<0.05)；ISO 20组的神经功能评分相对MCAO组降低(t=5.38，P<0.01)。脑梗死后各组脑组织水含量差异有统计学意义(P<0.01)，MCAO组相对sham组脑组织水含量升高(t=5.96，P<0.01)；ISO 10组相对MCAO组水含量降低，差异无统计学意义(P>0.05)；ISO 20组相对MCAO组水含量降低，且差异具有统计学意义(t=3.77，P<0.05)。见图1。

2.2 ISO减轻脑梗死大鼠的神经元损伤

与sham组相比，脑梗死各组大鼠脑组织中TUNEL阳性细胞百分比增加，差异有统计学意义(P<0.01)。其中，MCAO组相对sham组TUNEL阳性细胞率升高(P<0.01)；ISO 10组TUNEL阳性细胞率相对MCAO组降低(P<0.01)；ISO 20组TUNEL阳性细胞率相对MCAO组降低(P<0.01)。ISO处理可减轻脑梗死后TUNEL阳性细胞的增加，差异有统计学意义(P<0.01)。HE染色显示四组的组织学变化中，sham组无明显组织病理异常，细胞轮廓清晰，核仁明显。然而，脑梗死后出现细胞轮廓模糊、细胞变形和水肿等异常。ISO可减轻上述损伤，且ISO 20组对细胞病理状态的改善更为明显。Nissl染色则显示，sham组的神经元完好，而脑梗死诱导的神经元损伤伴随细胞体和核仁萎缩。与HE染色结果相似，ISO处理可明显减轻脑梗死后神经元的损伤。见图2。

2.3 ISO减轻脑梗死引起的大鼠氧化应激

与sham组相比，脑梗死各组ROS含量升高(P<0.01)、MDA含量升高(P<0.01)，SOD含量降低(t=22.80，P<0.01)。ISO处理后可减轻氧化应激，ISO 10组和ISO 20组相对MCAO组，ROS含量、MDA含量均降低(P<0.01)，SOD含量升高(P<0.01)。见图3。

2.4 ISO减轻脑梗死引起的炎症反应

据报道[11-12]，脑梗死后炎症的加重促进了神经元和脑组织损伤。因此，本研究分析ISO处理对脑梗死后大鼠炎症反应的影响。血清和脑组织结果显示，脑梗死后TNF-α和IL-6水平较sham组升高，差异有统计学意义(均P<0.01)。与MCAO组相比，ISO 10组TNF-α、IL-6水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)，ISO 20组对炎症因子释放的抑制作用更明显。MCAO组与sham组大鼠血清及脑组织的抗炎因子IL-10水平差异均无统计学意义(P>0.05)。与MCAO组相比，ISO组IL-10水平呈剂量依赖性增加，差异有统计学意义(P<0.01)。见图4。

2.5 ISO抑制脑梗死大鼠NLRP3炎性小体活化

由于NLRP3炎性小体的激活伴随着IL-1β和IL-18的释放在脑梗死后炎症反应的调控中起着重要的作用[13-15]，于是研究了脑梗死大鼠脑组织中NLRP3炎性小体相关蛋白的水平及IL-1β和IL-18的含量。Western blotting的结果表明，NLRP3和ASC的蛋白水平在脑梗死大鼠中上调，差异有统计学意义(P<0.01)，ISO 10组、ISO 20组表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。同时，在脑梗死大鼠脑组织中IL-1β和IL-18的含量在脑梗死大鼠中上调，差异有统计学意义(P<0.01)，ISO 10组、ISO 20组表达水平下降，差异均有统计学意义(P<0.01)。见图5。

3 讨论

脑梗死是一种全球发病率较高的严重脑血管疾病，目前尚无有效的临床药物，其临床管理仍颇具挑战性。缺氧和神经炎症引起的脑损伤贯穿于脑梗死急性期整个过程。因此，抑制神经炎症和氧化应激成为脑梗死治疗的主要应对策略。

ISO在炎症应激下产生抗菌、抗炎和抗肿瘤作用，因其在脑梗死中的临床应用逐渐普及。既往研究[16-17]表明，ISO通过调节细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinases，ERK1/2)、p38的磷酸化活性显著抑制脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的小鼠腹腔巨噬细胞的整体炎症反应水平，并缓解急性肺损伤中的炎症反应以减轻肺部损伤。

脑梗死后多出现神经元凋亡、核仁萎缩、水肿。本研究中，ISO显著降低脑梗死引起的神经功能评分和脑组织含水量，并减轻上述损伤，提示ISO对脑梗死大鼠具有保护作用，可能是一种治疗脑梗死的有效药物。

脑组织易受氧化应激的影响可归因于神经递质自动氧化、线粒体功能紊乱和不饱和脂质的富集等[18-20]。Zhao等[20]认为，在大鼠脑梗死再灌注损伤模型中，MDA水平增加，而SOD含量下降，ROS、MDA和SOD之间的平衡可用于评估氧化应激对脑损伤的影响。本研究中，ISO可降低ROS和MDA的水平，并上调SOD表达，ISO 20组尤为明显，表明ISO对脑梗死的保护作用之一可能是抗氧化作用。

促炎症细胞因子如TNF-α和IL-6，以及抗炎因子IL-10也被证实参与了脑梗死后炎症调节过程[21-22]。本研究显示，在血清和受伤的脑组织中，ISO明显抑制了TNF-α和IL-6的分泌，ISO剂量在20 mg/kg时对炎症因子释放的抑制作用更明显；同时呈剂量依赖性促进了IL-10的释放，表明ISO可减轻脑梗死炎症反应。

NLRP3炎性小体是一种亚细胞多蛋白复合物，与神经炎症密切相关，包括NLRP3和ASC等重要蛋白，可促进IL-18和IL-1β的产生[22]。Yang等[23]在NLRP3(-/-)小鼠中进行了大脑中动脉闭塞再灌注实验，发现下调NLRP3可通过抑制IL-1β的分泌，显著减少梗死区域，减轻血脑屏障的损伤。Xiao等[24]发现，脑出血是卒中最致命的亚型，可诱导NLRP3炎性小体的激活，导致一系列炎症反应和神经炎症，加重脑损伤。Joaquim等[25]在脑缺血/再灌注损伤模型中注射NLRP3抑制剂MCC950，发现MCC950可降低脑组织的过氧化作用。本研究中，ISO不仅抑制了NLRP3和ASC的蛋白水平，而且还减少了MCAO大鼠的IL-18和IL-1β的产生，提示NLRP3炎性小体是ISO治疗脑梗死的靶点，与既往研究[22-25]结果基本一致。

综上，ISO可降低脑梗死引发的神经功能评分和脑组织含水量，减轻神经元凋亡、核仁萎缩、水肿程度，降低ROS、MDA、TNF-α、IL-6、IL-18、IL-1β、NLRP3和ASC的表达水平，上调SOD、IL-10表达，减轻神经炎症反应，可能是脑梗死的潜在治疗药物。