藏药材唐古特铁线莲质量标准提升

万玉莹，陈晓奇，王喜锟，邓顺艳，邹海飞，周燕，达娃卓玛1，*（1.中药（藏药）质量控制重点实验室 西藏自治区食品药品检验研究院，拉萨 850005；.西藏大学，拉萨 85001；.中国科学院成都有机化学研究所，成都 61001；.中国科学院成都生物研究所，成都 6100）

唐古特铁线莲[Clematis tangutica（Maxim.）Korsh.]是毛茛科（Ranunculacea）铁线莲属（ClematisL.）藤本植物，又称甘青铁线莲，藏文名称“叶芒那布”，主要分布于青海和西藏等高原地区，地上部分入药[1]。据《晶珠本草》和《藏药志》等藏药典籍记载，其性辛、甘、温，祛寒，增生胃火，活血通瘀，破痞瘤积聚[2-3]，对心血管系统疾病有良好的疗效，常用于治疗消化不良，寒性肿瘤等症[4]，是藏成药益心康泰胶囊的组方药材之一[5]。目前，从唐古特铁线莲中共分离得到72种化学成分，主要是三萜皂苷类化合物，苷元多为齐墩果烷型五环三萜结构，主要分为常春藤皂苷元型三萜皂苷（43种）和齐墩果酸型三萜皂苷（12种）。其中常春藤皂苷元型三萜皂苷具有心肌保护抗缺血性脑损伤抗肿瘤细胞和抗菌活性等[6-11]。

1995年卫生部颁《中华人民共和国卫生部药品标准》藏药（第一册）收载的唐古特铁线莲药材质量标准水平低，包括名称、来源、性状、生药鉴别、炮制、性味与归经、功能与主治、用法与用量、贮藏[12]，无法达到质量控制目的，所以亟需对其质量标准进行修订提高。本研究根据《中国药典》2020年版第四部通则相关规定，增补薄层鉴别、含量测定、各检查项及浸出物等检测项目[13]，以其为藏药材质量标准进一步完善奠定基础。

1 材料

1.1 仪器

Waters Acquity UPLC H-CLASS液相色谱仪（四元泵，PDA检测器，柱温箱，自动进样器，Empower 色谱数据工作站）；Sartorius BT 25 S（十万分之一）和 BSA124S-CW（万分之一）电子天平（德国赛多利斯公司）；常春藤皂苷元对照品（中国食品药品检定研究院，含量以98.3%计）；硅胶G板（青岛海洋化工有限公司）。

1.2 试药

唐古特铁线莲药材19批次，采集自西藏自治区及青海省不同地区，经西藏自治区藏医院格桑巴珠副主任药师和四川省中医药科学院周毅研究员鉴定为毛茛科植物唐古特铁线莲[Clematis tangutica（Maxim.）Korsh.]。7～8月花果期采集地上部分，切段晒干，粉碎后过2号筛，混合均匀，备用。样品信息见表1。甲醇、乙腈为色谱纯（美国Fisher公司）；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

表1 唐古特铁线莲药材采集信息Tab 1 Sample information of Clematis tangutica (Maxim.) Korsh.

2 方法与结果

2.1 药材性状特征

本品茎细长，有时弯曲，具纵棱，灰棕色或棕褐色，质硬而脆，易折断，断面较平坦，白色；叶卷曲皱缩，破碎，棕褐色或灰绿色，展开后小叶片呈狭长圆形或披针形，深裂，边缘具缺刻状锯齿，背面被疏毛；花呈荷苞状，有的压扁，桔黄色，萼片4，长椭圆形，先端渐尖，外面被柔毛；果序呈绒球状或扁绒球状，柄长，瘦果倒卵形，长约4～7 mm，具长柔毛。气微，味微苦[12]。唐古特铁线莲干燥药材见图1。

图1 唐古特铁线莲干燥药材Fig 1 Dry medicinal material of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh.

2.2 显微特征

2.2.1 靠近根部的茎横切面 类圆形，表皮细胞1列；双层纤维束呈环状排列，大小不一，月牙形，外环一周环绕约14～18个，内环一周环绕约11～13个；外韧维管束周状排列，呈倒卵形，一周环绕约7～8个，长径约占横切面半径的2/5，木质部呈倒三角状，形成层不明显；髓部呈类圆形，约占横切面半径的 1/6，髓射线7～8条，放射状分布在髓部外周到皮层（见图2）。

图2 靠近根的茎横切面Fig 2 Cross section of the stem near the root

2.2.2 茎横切面 类圆形，表皮细胞1列；皮层偶见次生保护组织周皮细胞2～3列；纤维束呈环状排列，类半圆型，约占横切面半径的1/4，一周环绕约12～13个；外韧维管束类椭圆形，长径约占横切面半径的2/5，周状排列，一周环绕约12个；髓部约占横切面半径的 1/5，由15～20列细胞环绕排列组成（见图3）。

图3 茎横切面Fig 3 Cross section of the stem

2.2.3 主叶脉横切面 上、下表皮细胞各1列，椭圆形或类圆形；叶肉大型薄壁细胞，3～4列疏松排列；上表皮内侧见栅栏组织1～2列，紧密排列；海绵组织细胞3～4列，疏松排列且不规则；中部有双韧维管束，类卵形，长径约占横切面宽度的1/3，韧皮部细胞紧密排3～5列（见图4）。

图4 主叶脉横切面Fig 4 Cross section of the main vein

2.2.4 生药粉末 非腺毛多细胞多碎断，细胞连接处常有细胞缢缩，顶端细胞呈类椭圆形；叶表皮细胞表面观为呈类多角形，气孔为不定式，散在草酸钙结晶，呈多面体形，表面观呈多角形[12]；纤维成束，导管多为具缘纹孔导管、螺纹导管和环纹导管，直径14.09～68.46 µm；种毛多见，透明，多断裂（见图5）。

图5 生药粉末Fig 5 Crude drug powder

2.3 薄层鉴别

2.3.1 对照品、供试品溶液制备 称取常春藤皂苷元对照品适量，加甲醇溶解制成质量浓度为1 mg·mL－1的对照品溶液。供试品溶液按照“2.7.3”项下方法制备。

2.3.2 方法 照薄层色谱法（通则0502），吸取上述对照品溶液2 μL，供试品溶液2～3 μL，点于同一硅胶 G 薄层板，以环己烷-乙酸乙酯-冰醋酸（6∶4∶0.25）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸-乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，可在样品及对照品相应位置上观察到相同的紫红色斑点[14]（见图6）。

图6 唐古特铁线莲TLC图Fig 6 TLC of Clematis tangutica（Maxim.）Korsh.

2.4 水分测定

不同产地的唐古特铁线莲药材水分含量7.51%～12.55%，平均值含量为9.8%。以平均值上浮30%为上限，暂定本品水分不得过13.0%[15]。19批药材水分合格率为100%，结果见表2。

2.5 灰分、酸不溶性灰分测定

不同产地的唐古特铁线莲药材总灰分含量为4.54%～7.68%，平均值为5.9%，以平均值上浮30%为上限，暂定本品总灰分含量不得过8.0%。酸不溶性灰分含量为0.10%～1.06%，平均值为0.36%，但批次T2020-01、T2020-10酸不溶性灰分含量分别为0.95%、1.06%，考虑到唐古特铁线莲药材虽为地上部分入药，但在采收集过程中难免掺入泥沙，故建议将酸不溶性灰分含量限量暂定为不得过1.00%[16]。药材总灰分合格率约为100%，酸不溶性灰分合格率约为95%。结果见表2。

表2 水分、总灰分、酸不溶性灰分的测定结果(n＝2)Tab 2 Water，total ash and acid insoluble ash (n＝2)

2.6 浸出物测定

随机选取一批药材为代表（批号：T2020-02），对浸出物提取方法和提取溶剂进行考察。结果表明，热浸法以纯水作为溶剂时得到浸出物含量最高，结果见表3。以热浸法水提19批不同产地唐古特铁线莲药材，结果水溶性浸出物含量为21.16%～40.32%，平均值为30.6%，以药材干燥品平均值70%为下限，暂定本品水溶性浸出物不得少于20.0%。药材浸出物合格率为100%。结果见表4。

表3 浸出物提取方法的考察(n＝2)Tab 3 Extraction method(n＝2)

表4 水溶性浸出物含量(n＝2)Tab 4 Content of water-soluble extract (n＝2)

2.7 常春藤皂苷元含量测定

2.7.1 色谱条件 色谱柱：纳谱分析 Chrom CoreC18（Ⅱ）（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%磷酸水＝85∶15；流速1.0 mL·min－1；检测波长 210 nm；柱温 30℃；进样量 10 µL。

2.7.2 对照品溶液的制备 精密称取常春藤皂苷元对照品适量，用甲醇稀释得到1005.5 μg·mL－1的对照品储备液。精密吸取对照品储备液2 mL，用甲醇定容到10 mL量瓶中，得到201.1 μg·mL－1的对照品溶液。

2.7.3 供试品溶液的制备 精密称取唐古特铁线莲药材粉末（过2号筛）1.0 g，精密加入75%乙醇50 mL，称量。常温超声（200 W，53 kHz）30 min，放置室温，称量，用75%乙醇补足减失的重量；摇匀，过滤，精密量取续滤液25 mL，加入浓盐酸3 mL水浴回流4 h，静置，冷却，转移至分液漏斗，二氯甲烷萃取6次，每次20 mL，合并提取液，旋干，残渣加适量甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，随后用甲醇定容，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，续滤液作为供试品溶液[17]。

2.7.4 系统适用性试验 精密吸取对照品溶液、供试品溶液、空白溶液（甲醇）进行测定。结果显示，常春藤皂苷元与相邻色谱峰的分离度均＞1.5，与其他组分可以达到完全分离，对称因子在0.95～1.05，峰形对称，理论塔板数≥7000，结果见图7。

图7 常春藤皂苷元HPLC色谱图Fig 7 HPLC chromatogram of hederagenin

2.7.5 线性关系考察 精密量取“2.7.2”项下对照品储备液0.025、0.05、0.1、0.5、1、2、3、5、10 mL置10 mL量瓶中，制成常春藤皂苷元对照品系列溶液；以对照品质量浓度（X，μg·mL－1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归[18]，得回归方程为Y＝9.473×103X＋4.652×104（r＝0.9999），结果表明，常春藤皂苷元在2.5137～1005.5 μg·mL－1与峰面积线性关系良好。

2.7.6 定量限与检测限考察 精密量取“2.7.2”项下对照品储备液逐步稀释，进样测定，按照信噪比（S/N）约为 10∶1 计算，得到常春藤皂苷元定量限为25.14 ng；按S/N约为 3∶1计算，得到常春藤皂苷元检测限为7.54 ng。

2.7.7 仪器精密度考察 对照品溶液连续进样6次，记录峰面积。结果常春藤皂苷元峰面积的RSD为0.60%，表明该仪器精密度良好。

2.7.8 重复性考察 取同一批药材（批号：T2020-02）平行进行6次试验，结果显示，常春藤皂苷元含量的RSD为1.7%，表明该方法重复性良好。

2.7.9 稳定性考察 取药材（批号：T2020-02）制样后 0、2、4、6、8、10、12 h 进样，记录峰面积。结果常春藤皂苷元的峰面积RSD为0.72%，表明供试品溶液在12 h内稳定。

2.7.10 加样回收率考察 精密称取已知含量的唐古特铁线莲药材（批号：T2020-02）9份，每份约0.5 g，按待测成分含量的80%、100%、120%精密加入质量浓度为0.042 72、0.052 24、0.062 70 mg·mL－1的常春藤皂苷元溶液50 mL，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率。结果显示，常春藤皂苷元低、中、高质量浓度平均加样回收率分别为99.25%、98.02%、98.89%，RSD分别为0.85%、1.6%、1.2%，表明方法准确度良好。

2.7.11 样品测定 分别取青海、西藏各不同产地的唐古特铁线莲药材，按“2.7.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算常春藤皂苷元的含量。结果表明，19批唐古特铁线莲样品常春藤皂苷元含量差别很大，在 0.074%～1.667%，平均含量为0.591%，结果见表5。

表5 常春藤皂苷元含量测定结果 (n＝3)Tab 5 Content determination of hederagenin (n＝3)

2.7.12 样品中常春藤皂苷元含量限量规定 由“2.7.11”项下测定结果可知，19批唐古特铁线莲样品中常春藤皂苷元最高含量约为最低含量的23倍，变异系数为129%，若按照平均值的80%为限量，则含量不得低于0.473%，此时合格率为53%，这一结果表明常春藤皂苷元限量的制订不能采用简单的平均法[19]。本研究采用一种新的思路来制订常春藤皂苷元限量以供参考。其核心思想是认为在采样范围内有一部分唐古特铁线莲药材中常春藤皂苷元的含量达不到设定的含量限度，例如当有10%的样品中常春藤皂苷元含量达不到定量限度时（即有90%的样品可以达到含量限度，合格率为90%），把此部分样品中含量最高值定为该品种药材最低限量。

首先通过Cubic插值法结合统计学原理，由现有离散含量数据推算出总体药材（采样范围内所有该种药材）中常春藤皂苷元含量的向上累计频率分布数据，如图8所示。图中横坐标表示药材中常春藤皂苷元含量，图中记作“常春藤皂苷元含量x”；纵坐标表示常春藤皂苷元含量低于某一值的所有药材在全部药材中所占比重，即统计学上的“累计频率”，图中记作“累计频率P”。通过四次多项式拟合得出如下回归方程：

图8 常春藤皂苷元含量上限与低于该限量药材所占比重（累计频率P）拟合曲线图Fig 8 Fitting curve between the upper limit of Hederagenin content and the proportion of medicinal materials lower than the limit value（cumulative frequency P）

P＝－0.1266＋2.3369x－2.3012x2＋ 1.0480x3－0.1608x4（Adj.R2＝0.9864）

据此回归方程可知，当P＝0.1时，含量x为0.108%，按干燥品计算，暂定唐古特铁线莲样品中常春藤皂苷元含量不得低于0.10%，最终样品合格率为95%。需要指出的是由于拟合数据源的x在0.074%～1.667%，出于严谨性，本公式仅能够在上述范围内进行有效的计算。

3 讨论

3.1 对照物质的选择

青海产唐古特铁线莲的质量标准研究有以齐墩果酸[20]、芦丁[21]、槲皮素、山柰酚、异鼠李素[22]为对照物质进行含量测定的，但尚未收录至药品标准当中。前期寻找不同产地唐古特铁线莲药材共同对照物质较为困难，而文献所报道的相关对照品均未在西藏产唐古特铁线莲药材中发现。常春藤皂苷元型三萜皂苷是唐古特铁线莲药材的主要化学成分及活性成分，但常春藤皂苷类成分在紫外可见光区无吸收，且以其中一种常春藤皂苷类成分作为对照物质，往往含量太低，达不到定量要求。故本试验将各种常春藤皂苷类成分水解后得到常春藤苷元，其在紫外末端有吸收且可以达到定量的要求，从而间接对唐古特铁线莲药材药效组分进行控制。药理活性研究表明，常春藤皂苷元具有抗肿瘤、抗抑郁、抗菌抗炎、抗糖尿病等多种药理作用[23]。因此，考虑临床功效、含量高低、特征性等因素，本课题将常春藤皂苷元作为对照物质，制订关于药材中药效活性组分的质量控制方法。

3.2 含量测定

3.2.1 供试品溶液制备方法的考察 对供试品制备方法进行考察，采用不同浓度的甲醇、乙醇溶液（50%、75%、100%）作为提取溶剂，发现当提取溶液在75%乙醇时，得到常春藤皂苷元含量最高。在此基础上，考察超声、回流两种提取方式对常春藤皂苷元含量的影响，两种方式下提取含量接近，考虑到节约提取时间，最终确定提取方式为超声30 min。萃取溶剂考察了石油醚、二氯甲烷、三氯甲烷的萃取效果，结果发现使用三氯甲烷为萃取溶剂时所得常春藤皂苷元含量是二氯甲烷作为萃取溶剂的1.1倍，但是三氯甲烷毒性较大，为管制化学试剂，最终选择二氯甲烷作为萃取溶剂。考察二氯甲烷萃取4次、6次、8次，结果萃取6次可保证常春藤皂苷元提取完全。对比硫酸、盐酸以及不加酸提取4 h常春藤皂苷元含量，结果使用盐酸水解4 h时提取率较高，确定盐酸作为水解溶剂。

3.2.2 色谱条件考察 考察了甲醇-冰醋酸（0.2%、0.4%）、甲醇-磷酸水（0.1%、0.2%）、甲醇-水-冰醋酸-三乙胺（87∶13∶0.04∶0.02）、乙腈-0.1%磷酸水等流动相体系，综合考虑压力、峰形以及样品分离效果等因素，最终确定流动相为甲醇-0.1%磷酸水＝85∶15。

3.2.3 不同产地质量标准理化测定结果差异性分析 为了比较青海、西藏产地（藏医院及藏药厂收集药材均来自西藏地区）唐古特铁线莲品质的差异，利用统计学软件SPSS 19.0对19批唐古特铁线莲样品中水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物及常春藤皂苷元含量进行独立样本t检验[24]。

结果西藏产地药材水分含量显著高于青海，推测是因为西藏药材收集时间在雨季，所以西藏产唐古特铁线莲药材在产地加工、储运及使用过程中要加强对水分的管理，防止药材霉变现象的发生；青海、西藏两产地间灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物及常春藤皂苷元含量无明显差异，但是西藏地区8批次药材中常春藤皂苷元含量变异系数约为137%，青海地区11批次药材中常春藤皂苷元含量变异系数约为76%，显然西藏地区药材中常春藤皂苷元含量范围跨度较大，因此以常春藤皂苷元作为对照物质来体现药材的品质，青海产唐古特铁线莲药材整体上要优于西藏产唐古特铁线莲药材。

3.3 小结

本研究通过对多产地唐古特铁线莲药材性状描述、显微鉴别及薄层鉴别，可知该植物鉴别特征明显，可作为唐古特铁线莲药材的鉴别依据；通过对唐古特铁线莲药材各检查项及浸出物测定，初步确定各常规检测项限量；通过建立常春藤皂苷元对照品的含量测定方法，初步确定唐古特铁线莲药材质控指标性化学成分及限量，为其品种鉴别、药材质量标准的完善及进一步开发利用提供依据；首次采用Cubic插值法结合统计学原理拟合曲线法制订对照物质限量，为目前质量标准研究中含量限度制订方法提供新的参考。