过氧化碳酰胺合成工艺的优化

林新文，唐闪光，朱光冕，陈娜（.湖南省药品审核查验中心，长沙 4000；.湖南一格制药有限公司，湖南湘潭 400；.湖南中医药大学第一附属医院，长沙 400）

注射用过氧化碳酰胺是临床上一种常用的静脉给氧药物[1]，由过氧化氢与尿素以氢键结合形成[2]。经静脉注射后，过氧化碳酰胺在体内会先缓慢分解形成过氧化氢，在过氧化氢酶的作用下缓慢释放出氧分子，从而改善机体缺氧情况[3]，可用于因缺氧所导致的多种急重症的抢救与治疗[4-6]。该产品自上市销售以来，其安全性和有效性均获得了广大医师和患者的认同。随着生产批次的积累，发现产品在贮存时稳定性不佳，常出现炸瓶等不稳定现象，而这都是由于过氧化碳酰胺原料本身不稳定造成的，所以急需对过氧化碳酰胺原料工艺进行优化，以提高其稳定性，进而提高其制剂的稳定性。

研究发现金属离子、光照、温度等因素[7-8]，都会使过氧化碳酰胺分解，导致其pH和含量发生变化。螯合剂作为一种常用的药用辅料[9]，可通过与金属离子以配位键连接形成含金属离子的杂环结构，来减少金属离子对于药品的影响[10-12]。因此，可通过在制备过程中添加金属离子螯合剂[13]和pH调节剂[14]来增加过氧化酰胺的稳定性和储藏性能。基于此，本研究以过氧化碳酰胺pH、含量和收率为指标，pH调节剂种类和添加量、乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）添加量为因素，对其处方进行优化；以溶解水浴温度、析晶温度、干燥温度为因素，对其制备工艺进行优化；采用长期稳定性试验和加速稳定性试验考察过氧化碳酰胺的稳定性，可为过氧化碳酰胺原料生产产业化提供依据。

1 材料

1.1 仪器

DMH-2型对开门干燥灭菌烘箱（南京长兴制药机械有限公司）；876A型数显真空干燥箱（上海浦东跃欣科学仪器厂）；MA105DU型电子天平（精度：0.1 mg，梅特勒-托利多仪器有限公司）；SSW-600-2S型恒温水浴锅（上海博讯医疗生物仪器股份有限公司）；PHS-3C雷磁pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；Labonce-250GS药品稳定性试验箱（北京兰贝石恒温技术有限公司）。

1.2 试药

尿素（批号：190305，湖南芙蓉制药有限公司）；过氧化氢溶液（批号：191008、191009，成都明日制药有限公司）；枸橼酸（批号：100820170407）、乙二胺四乙酸二钠（批号：102320190701）（湖南尔康制药股份有限公司）；磷酸二氢钠（批号：20210506，分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸（分析纯，湖南汇虹试剂有限公司）；水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 过氧化碳酰胺制备原有工艺

称取126 g浓过氧化氢溶液（折合H2O2为34.01 g）以及60.06 g尿素于烧杯中（使过氧化氢与尿素的摩尔比为1∶1），35℃水浴加热搅拌溶解后保温5 min，使其充分反应。将反应后的溶液经0.45 μm的聚丙烯滤膜过滤后进行冷却析晶，冷却至0～4℃时开始计时，低温静置析晶12～24 h，倾去母液得结晶1，母液按照上述条件进行第二次结晶，弃第二次结晶后母液得结晶2，将结晶1和结晶2混合置于真空干燥箱中，30℃左右真空干燥24～36 h，即得过氧化碳酰胺（合成工艺见图1）。

图1 原有合成工艺路线Fig 1 Original synthetic process route

2.2 过氧化碳酰胺优化工艺

称取126 g浓过氧化氢溶液（折合H2O2为34.01 g）于烧杯中，依次加入乙二胺四乙酸二钠0.12 g和枸橼酸0.82 g，搅拌均匀，向搅拌后的溶液中加入60.06 g的尿素（使过氧化氢与尿素的摩尔比为1∶1），30～40℃水浴加热搅拌溶解后保温5 min，使其充分反应。将反应后的溶液经0.45 μm的聚丙烯滤膜过滤后进行冷却析晶，冷却至－4℃开始计时，维持析晶料液－7～0℃低温搅拌析晶10～12 h，析晶完成后，将母液收集按照上述条件进行二次析晶，晶体转入过滤器中，经200～400目尼龙筛布过滤，得过氧化碳酰胺湿品。将过氧化碳酰胺湿品铺盘置于真空干燥箱中，30～40℃下真空干燥24～36 h，即得过氧化碳酰胺（合成工艺见图2）。

图2 优化的合成工艺路线Fig 2 Optimized synthetic process route

2.3 过氧化碳酰胺质量的评价指标

2.3.1 过氧化碳酰胺pH测定 取样品4.0 g精密称定，加新沸过并放冷的超纯水15 mL充分搅拌使其溶解，制备成待测溶液，于25℃测pH值，测定3次，计算平均值。pH应在3.2～3.7，确保产品符合质控要求。

2.3.2 过氧化碳酰胺的含量测定 由于过氧化碳酰胺为过氧化氢和尿素的晶体加合物[15]，故本试验中过氧化碳酰胺的含量均以其中过氧化氢的含量来计算。取样品0.1 g精密称定，置于碘瓶中，加水25 mL与冰醋酸5 mL溶解后，加碘化钾2 g，钼酸铵试液1滴，遮光放置10 min，用0.1 mol·mL－1的硫代硫酸钠滴定，至近终点时加淀粉指示液3 mL，继续滴至蓝色消失，并将滴定的结果用空白试验校正。每1 mL硫代硫酸钠滴定液（0.1 mol·mL－1）相当于1.701 mg的过氧化氢。

2.3.3 过氧化碳酰胺收率的计算 过氧化碳酰胺合成基本反应方程式如下：

H2O2＋CH4N2O → CH4N2O·H2O2

收率（%）＝60.06×m/94.07×M×100%

式中m为实际产量（g），M为尿素质量（g）。

2.4 过氧化碳酰胺处方的优化过程

2.4.1 pH调节剂的种类 称取126 g浓过氧化氢溶液，0.18 g乙二胺四乙酸二钠，60.06 g尿素，pH调节剂1.0 g，水浴溶解35℃保温，－4℃低温搅拌析晶，真空干燥温度35℃，按“2.2”项下方法制备，“2.3”项下方法测定评价指标，考察不同种类pH调节剂对过氧化碳酰胺pH、含量和收率的影响。结果显示，pH调节剂种类对过氧化碳酰胺pH有很大影响，当选用磷酸二氢钠＋磷酸或单独的磷酸作为pH调节剂时，样品pH较高，第一次结晶收率较低。当选用枸橼酸为pH调节剂时，样品pH较低，第一次结晶收率较高。故选择枸橼酸作为pH调节剂。结果见表1。

表1 pH调节剂对过氧化碳酰胺pH、含量和收率的影响Tab 1 Effect of pH regulator on pH、content and yield of urea peroxide

2.4.2 枸橼酸的用量 称取126 g浓过氧化氢溶液，0.18 g乙二胺四乙酸二钠，60.06 g尿素，水浴保温温度35℃，冷却搅拌析晶温度－4℃，真空干燥温度35℃，按“2.2”项下方法制备，按“2.3”项下方法测定评价指标，考察枸橼酸添加量（0.64、0.82、1.00、1.18、1.36 g）对过氧化碳酰胺pH、含量和收率的影响。结果显示，当枸橼酸添加量为0.82 g和1.00 g时，过氧化碳酰胺含量和第一次结晶收率均较其他组高，而从添加外来物质越少越好的角度考虑，本文选择枸橼酸添加量为0.82 g。结果见表2。

表2 枸橼酸添加量对过氧化碳酰胺pH、含量和收率的影响Tab 2 Effect of citric acid additive amount on pH、content and yield of urea peroxide

2.4.3 螯合剂的用量 称取126 g浓过氧化氢溶液，0.82 g枸橼酸，60.06 g尿素，水浴保温温度35℃，冷却析晶温度－4℃，真空干燥温度35℃，按“2.2”项下方法制备，按“2.3”项下方法测定评价指标，考察不同乙二胺四乙酸二钠添加量（0.12、0.15、0.18、0.21、0.24 g）对过氧化碳酰胺pH、含量和收率的影响。结果显示，随着乙二胺四乙酸二钠添加量的增加，过氧化碳酰胺第一次结晶后，含量呈下降趋势，且添加量为0.12 g时结晶收率最高，综合试验结果和成本考量，后续工艺选择最小添加量0.12 g。

2.5 过氧化碳酰胺制备工艺的优化过程

2.5.1 水浴温度 称取126 g浓过氧化氢溶液，按“2.4”项下最优处方，固定冷却析晶温度－4℃，真空干燥温度35℃，按“2.2”项下方法制备（由于二次结晶收率较低，且结晶时间较长，故后续工艺均不再进行二次结晶），考察不同水浴温度（25、30、35、40、45℃）时尿素的溶解时间和溶解情况，结果见表4。结合溶解时间和溶解情况，后续工艺选择30～40℃作为最佳水浴温度。

表4 水浴温度对过氧化碳酰胺溶解反应的影响Tab 4 Effect of water bath temperature on dissolution reaction of urea peroxide

表3 螯合剂添加量对过氧化碳酰胺pH、含量和收率的影响Tab 3 Effect of chelating agentadditive amount on pH，content and yield of urea peroxide

2.5.2 析晶温度 称取126 g浓过氧化氢溶液，按“2.4”项下最优处方，固定水浴保温温度35℃，真空干燥温度35℃，按“2.2”项下方法制备，按“2.3”项下方法测定，考察不同析晶温度（0～4℃、－4～0℃、－8～－4℃、－12～－8℃）对过氧化碳酰胺pH、含量和收率的影响。结果显示，当析晶温度在4～－8℃时，可以析出细腻的结晶颗粒；随着温度降低，过氧化碳酰胺含量基本不变，收率呈逐步升高的趋势；当析晶温度为－12～－8℃时，液面出现结冰情况，不能进行搅拌；故后续工艺选择0～－7℃为最佳析晶温度。结果见表5。

表5 析晶温度对过氧化碳酰胺pH、含量和收率的影响Tab 5 Effect of crystallization temperature on pH，content and yield of urea peroxide

2.5.3 真空干燥温度 称取126 g浓过氧化氢溶液，按“2.4”“2.5”项下优化结果，固定水浴温度35℃，析晶温度0～－7℃，按“2.2”项下方法制备，按“2.3”项下方法测定，考察不同真空干燥温度（30、35、40、45℃）对过氧化碳酰胺pH和含量的影响。结果显示，随着干燥温度升高，干燥24 h的干燥失重和干燥36 h的干燥失重都呈逐步降低的趋势，但在30～40℃温度区间内，干燥温度对过氧化碳酰胺pH变化无影响，且在35℃时过氧化碳酰胺含量最大。故后续工艺选择30～40℃为最佳真空干燥温度。

表6 真空干燥温度对过氧化碳酰胺pH和含量的影响Tab 6 Effect of vacuum drying temperature on pH and content of urea peroxide

2.5.4 结晶次数确认 原工艺采用了母液两次结晶合并后再真空干燥的工艺。此工艺可以小幅提高产品的收率，但是一次结晶收得的湿品，需等与母液再次过夜重结晶的湿品合并才能进入真空干燥工序，一次结晶湿品的暂存时间偏长，不利于生产效率的提高。同时根据上述试验结果，第二次的结晶收率远远低于第一次的结晶收率，且第二次收得量很小，经权衡利弊，可将原两次结晶的工艺改为一次结晶的工艺，一次结晶后的湿品直接进入真空干燥工序，结晶母液弃去不用。

2.6 最佳处方及制备工艺的验证

称取126 g浓过氧化氢溶液，按“2.4”“2.5”项下最优处方及制备工艺制备过氧化碳酰胺。按“2.3”项下方法测定评价指标。每份样品平行操作3次，取平均值。结果显示，优化的处方和工艺制备的过氧化酰胺其pH、含量和收率均优于原工艺处方，这表明新处方及制备工艺下生产的过氧化碳酰胺较原工艺稳定，能获得更高的收率，符合产业化要求。结果见表7。

表7 优化的及原处方和工艺的验证结果Tab 7 Verification of optimal and original formulation and preparation technology

2.7 样品稳定性试验

2.7.1 长期稳定性试验方法 按“2.4”“2.5”项下最优处方及制备工艺制得过氧化碳酰胺原料。按照2020年版《中国药典》四部中“原料药物与制剂稳定性试验指导原则”[16]，对于温度特别敏感的药物，长期试验可在温度（5±3）℃条件下进行。取适量样品，以市售包装，（5±3）℃条件下放置6个月，分别在第0、3、6、9、12个月时取样，按照2020年版《中国药典》四部“原料药物及制剂稳定性重点考察项目”，考察其性状、pH、溶液的澄清度、干燥失重和含量。结果显示，过氧化碳酰胺性状均为白色结晶状，溶液呈澄清无色，其pH、干燥失重和含量与第0月相比均变化不大，表明其稳定，符合产品生产需求。结果见表8。

表8 长期稳定性试验结果Tab 8 Long-term stability test results

2.7.2 加速稳定性试验方法 按“2.4”“2.5”项下最优处方及制备工艺制得过氧化碳酰胺。按照2020年版《中国药典》四部中“原料药物与制剂稳定性试验指导原则”[16]，对温度特别敏感的药物，预计只能在冰箱（5±3）℃内保存使用，此类药物的加速试验，可在温度为（25±2）℃，相对湿度为（60±5）%的条件下进行。取适量样品，以市售包装，于温度为（25±2）℃，相对湿度为（60±5）%的条件下放置6个月，分别在第0、1、2、3、6个月时取样，按照2020年版《中国药典》四部“原料药物及制剂稳定性重点考察项目”，考察其性状、pH、溶液的澄清度、干燥失重和含量。结果显示，过氧化碳酰胺性状均为白色结晶状，溶液呈澄清无色，其pH、干燥失重和含量与第0月相比均变化不大，表明其稳定，符合产品生产需求。结果见表9。

表9 加速稳定性试验结果Tab 9 Accelerated stability test results

3 讨论

3.1 pH调节剂的选择

过氧化氢作为一种极弱酸（Ka＝2.4×10－12），在自然状态下极不稳定，存在典型的自加速分解过程[17]。孙峰等[18]研究发现，随着过氧化氢的pH值增加，反应起始放热温度降低，热失控危险性明显增加，当pH值增至7以上时，储存的过氧化氢极不稳定，极易发生热失控。故过氧化碳酰胺储存过程中pH值的稳定，对过氧化碳酰胺的储存性能有较大的影响。本研究通过单因素试验探究了不同pH调节剂及其最佳添加量。结果表明枸橼酸对产品pH具有较好的调节性，作为一种天然小分子有机酸，具有无毒无害，水中溶解性能好的优点[19]，且可与二、三价金属离子进行螯合[20]，提高过氧化碳酰胺的稳定性，因此本研究以枸橼酸作为pH调节剂。

3.2 螯合剂的选择

乙二胺四乙酸二钠作为药物中常用的金属离子螯合剂，具有广泛的配位性能[21]，对照品中的靶金属具有很高的螯合效率[22]，几乎与所有过渡金属都能生成水溶性好且稳定的螯合物，能有效防止药物被金属离子催化氧化[23]，增强药物的稳定性，且在高温条件下依然稳定[24]。故本研究选择乙二胺四乙酸二钠作为金属离子螯合剂。

3.3 水浴温度的选择

基于过氧化碳酰胺制备处方的改变，本研究探讨了在新处方下，过氧化碳酰胺制备的最佳工艺。结果表明在25～40℃，随着温度升高，尿素的溶解时间不断减少，当温度达到30℃时，尿素已完全溶解；当温度达到45℃时，样品表面产生汽泡。这是由于温度升高有利于尿素溶解和合成反应的进行，进而提高过氧化碳酰胺的收率，但温度过高会导致过氧化氢和过氧化碳酰胺分解[25]，因此选择30～40℃作为最佳反应温度。

3.4 真空干燥温度的选择

此外，本研究还探讨了真空干燥温度对产品干燥失重、pH和含量的影响。结果表明，在30～40℃，随着温度的升高产品真空干燥的失重减少，当温度达到40℃、干燥时间36 h时，产品失重只有0.2%，说明此时已基本去除产品中的水分和挥发性物质；且pH为3.6符合产品质控要求。当温度进一步升高时，产品干燥36 h的失重未再减少，但产品的pH升高，含量降低，说明此温度下，过氧化碳酰胺已分解，不适宜进行真空干燥。综合试验结果与能耗考量，选择30～40℃作为真空干燥温度。

本研究通过单因素试验探讨了过氧化碳酰胺制备的最佳处方及其工艺条件，稳定性试验表明新处方及工艺下所生产的产品均符合质控要求，稳定性好，可为过氧化碳酰胺原料生产产业化提供依据。