龙脷叶萃取部位的抗肿瘤活性筛选研究

李童，谢欣，雷智冬，黄锁义

(1. 右江民族医学院基础医学院，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院药学院，广西 百色 533000；3. 广西中医药大学药学院，广西 南宁 530000；4. 广西高校右江流域特色民族药研究重点实验室，广西 百色 533000)

龙脷叶具有润肺止咳、通便之功效，在民间使用广泛，其具有较好的抗炎和镇痛作用[1]。目前，国内外对壮药龙脷叶的研究主要有：基因组序列以及合成[2-3]、抗菌活性[4]、化学成分[5]、抗氧化[6]等，但未报道龙脷叶对SGC-7901、MCF-7、BEL-7404[7]3种癌细胞抗肿瘤作用的研究，为弥补空缺，本实验对此进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 SGC-7901、MCF-7、BEL-7404细胞株，均购于中国科学院昆明细胞库。

1.1.2 药品与试剂 龙脷叶，购自广西壮族自治区玉林市，经右江民族医学院覃道光副教授鉴定为大戟科守宫木属植物。(RPMI)1640、DMEM基础培养基(美国Gibco公司)；胎牛血清(FBS)(美国GEMINI公司)；Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒(碧云天公司)；95%乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、DMSO(二甲基亚砜)(成都科龙化工试剂厂)。

1.1.3 仪器 DMi8M倒置显微镜(德国Leica公司)；Mithras LB 943多功能酶标仪(德国Berthold公司)；W-O系列恒温水浴锅(郑州长城科工贸有限公司)；BC-R501旋转蒸发仪(上海贝凯生物化工设备有限公司)；Alpha1-2真空冷冻干燥机(德国)。

1.2 龙脷叶各部位的提取 以常规方法将晾干的龙脷叶粉碎成小颗粒，制备成25 kg，用6倍量体积的95%乙醇按以下方法进行回流提取，80 ℃恒温水浴加热回流3次，每次2 h，抽滤，合并滤液，旋转蒸发仪回收溶剂，得到浸膏，加入等体积的纯水，形成混悬液，再用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次进行萃取，分别抽滤合并石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂萃取液，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到各个溶剂浸膏，即石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水溶剂萃取物，用真空冷冻干燥机干燥，保存于4 ℃冰箱中，备用。使用前用DMSO(二甲基亚砜)溶解后再用完全培养基调整至实验所需的浓度，现配现用。

1.3 测定4个萃取部位对SGC-7901、MCF-7和BEL-7404细胞增殖抑制作用

1.3.1 细胞的培养与铺板3种细胞株的培养条件 含10%胎牛血清(FBS)和1×青链霉素的RPMI-1640或DMEM培养基，于37 ℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中静置培养。取正处于对数生长期的3种细胞株，使用胰酶进行消化，将细胞浓度调整为适宜的密度5×104个/毫升，100 μL等量接种于96孔板，在培养箱中静置培养24 h，待细胞贴壁生长，给药前观察细胞生长状态是否良好。

1.3.2 药物分组与给药 每株细胞分调零组(仅加培养液)，空白对照组(含细胞液和培养液)，阴性对照组(含细胞液和对应实验组中各浓度DMSO的培养液)，实验组(含细胞液、培养液以及药物)。待细胞贴壁培养24 h后，更换为含不同浓度的药物的培养基继续培养(每孔加入含不同浓度药物的培养基100 μL)，分别作用48 h，4种萃取物由低到高分为6组(0.05 mg/mL，0.1 mg/mL，0.2 mg/mL，0.4 mg/mL，0.8 mg/mL，1.6 mg/mL)。调零组、对照组和实验组均设3个复孔。

1.3.3 以CCK8法检测细胞活力 药物作用48 h后，先观察其生长状态，弃去旧的培养基，每孔加入含有5% CCK8的完全培养基90 μL，37 ℃避光孵育适宜时间1～2 h，于450 nm处读取各孔OD值。肿瘤细胞生长抑制率(IR%)=1-[(实验组OD值-调零组OD值)/(对照组OD值-调零组OD值)]×100%。通过GraphPad Prism5软件计算药物作用于3种细胞株的IC50值。

2 结果

2.1 4个萃取部位对SGC-7901、MCF-7和BEL-7404细胞株增殖的抑制作用 龙脷叶石油醚、乙酸乙酯萃取物对SGC-7901细胞增殖均有抑制作用，其肿瘤细胞存活率随药物浓度减少而增大，抑制作用随药物浓度增大而增加，见表1；对MCF-7细胞的抑制作用随药物浓度增加而增强，正丁醇和水溶剂萃取物两个部位萃取物活性差，见表2；对BEL-7404细胞的抑制作用随药物浓度增加而增强，正丁醇和水溶剂萃取物两个部位萃取活性差，无法计算IC50值，见表3。

2.2 比较4个萃取物对SGC-7901、MCF-7和BEL-7404细胞株的IC50值 龙脷叶的4个萃取物对SGC-7901、MCF-7和BEL-7404细胞的抑制作用，从图1、图2、图3可见，龙脷叶的石油醚、乙酸乙酯萃取物对SGC-7901、MCF-7、BEL-7404细胞的体外增殖均有抑制作用，其细胞存活率随着药物浓度增大从而减小，增殖抑制作用与药物浓度成正比，呈依赖性；正丁醇、水溶剂萃取物对3种细胞进行48 h干预后，其存活率未见减少，相反增多。龙脷叶的石油醚、乙酸乙酯萃取物对SGC-7901细胞的IC50分别为0.78 mg/mL和0.60 mg/mL；对MCF-7细胞的IC50分别为1.22 mg/mL和0.59 mg/mL；对BEL-7404细胞的IC50分别为0.64 mg/mL和0.49 mg/mL。其中，正丁醇和水部位萃取物活性差，计算不出IC50值，乙酸乙酯萃取物对3种肿瘤细胞的抗增殖作用最强。

表1 龙脷叶4个萃取部位对SGC-7901细胞增殖的影响

表2 龙脷叶4个萃取部位对MCF-7细胞增殖的影响

表3 龙脷叶4个萃取部位对BEL-7404细胞增殖的影响

图1 4个萃取部位对SGC-7901细胞活力的影响

图2 4个萃取部位对MCF-7细胞活力的影响

图3 4个萃取部位对BEL-7404细胞活力的影响

3 讨论

本实验结果表明，龙脷叶石油醚、乙酸乙酯萃取部位对3种肿瘤细胞株均产生抑制效果，细胞的存活率随着药物浓度的增大而减弱，抑制率随着药物浓度的增大而增强，具有剂量依赖性；其中，龙脷叶乙酸乙酯萃取物对SGC-7901、MCF-7、BEL-7404的IC50值最小，说明乙酸乙酯萃取物对3种肿瘤细胞相对比较敏感，抗肿瘤活性最好。龙脷叶乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂萃取部位体外抗肿瘤活性大小依次为：乙酸乙酯萃取部位>石油醚萃取部位；正丁醇和水部位萃取物的抗肿瘤作用不明显。本研究结果表明，龙脷叶乙醇提取物的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水溶剂萃取部位中，筛选出乙酸乙酯萃取部位是抗肿瘤活性最佳的部位。

本课题组对龙脷叶等壮药药材的抗氧化研究已经做了大量前期研究工作，现进一步对其抗肿瘤作用进行研究，筛选出其活性部位，为进一步分离抗肿瘤活性单体化合物以及研究抗肿瘤作用机制奠定坚实的基础。后期可参考刘森等[8]试验设计，探讨其作用机制。