三味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠药效及作用机制研究

秦华珍 黄焕迪 陈俊其 戴庆玲 何瑞坤 钟 贵 黄燕琼 柳俊辉

(1 广西中医药大学，南宁，530200；2 广西中医药大学第一附属医院，南宁，530023)

高良姜、大高良姜、红豆蔻3味中药同属于山姜属中药，它们的药性与功效具有相似性，都是性味辛温，归脾胃经，具有温中散寒、温胃止痛等功效，临床常用于脘腹冷痛、伤食吐泻等症[1]。现代研究表明高良姜、大高良姜、红豆蔻3味中药具有镇痛、抗炎、抗癌等药理活性，其中以高良姜素、小豆蔻明、山姜素等构成的黄酮类成分为其主要活性成分之一[2-5]。

本课题前期研究表明，山姜属中药有抗胃溃疡寒证的药效，其中主要活性成分黄酮类在体外有良好的抗氧化作用[6-7]。为了观察黄酮类成分在体内的药效，本研究提取3味山姜属中药黄酮类成分，以大鼠复制胃溃疡寒证模型，观察大鼠行为体征变化，测定血清中一氧化氮(Nitric Oxide,NO)、内皮肽(Endothelin，ET)、血小板活化因子(Platelet-activating Factor,PAF)、血栓素B2(Thromboxane B2,TXB2)、血清皮质素(Cortisone,COR)含量，探讨3味山姜属中药黄酮类成分温中散寒的药效及作用机制，为阐释中药“亲缘关系-活性成分-效用”的相互关系提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 无特定病原体(Specific Pathogen Free，SPF)级SD雄性大鼠，体质量180～220 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。在屏障系统SPF级环境下饲养，室内温度为(20±2)℃，相对湿度为40%～70%。动物伦理委员会审批号：DW20210311-021。

1.1.2 药物 高良姜、大高良姜、红豆蔻、知母均购自安国市冷背药材有限公司，批号：20181018，经我校中药鉴定学教研室田慧教授鉴定，高良姜为姜科植物高良姜(AlpiniaofficinarumHance)的干燥根；大高良姜为姜科植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的干燥根；红豆蔻为姜科植物大高良姜(AlpiniagalangalL.)的果实。知母为百合科植物知母(AnemarrhenaasphodeloidesBge.)的干燥根茎。

1.1.3 试剂与仪器 干姜姜辣素(西安宝益丰生物科技有限公司，批号：20190912)；95%乙醇(AR，西陇化工股份有限公司，批号：20190316)；氢氧化钠(AR，上海麦克林生化科技有限公司，批号：C10492126)；盐酸(AR，西陇化工股份有限公司，批号：20190507)；冰乙酸(AR，西陇化工股份有限公司，批号：20190507)；羧甲基纤维素钠(AR，国药集团化学试剂有限公司，批号：20180110)。NO试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20190716)；ET、PAF、TXB2、COR试剂盒(Bioswamp武汉贝茵莱生物科技有限公司，批号：201908)。

粉碎机(上海顶佳工贸，型号：DJ-1500)；旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂，型号：RE-6000A)；低速离心机(上海安亭科学仪器厂，型号：TDL-5-A)；冰箱(青岛海尔股份股份有限公司，型号：BCD-210DCM)；酶标仪(上海科华实验系统有限公司，型号：ST-360)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备 取SPF级SD大鼠90只，随机取10只为空白组，其余大鼠进行胃溃疡寒证造模，每天早上灌服冰知母(4 ℃)水煎液(剂量10.44 g/kg，生药量0.5 g/mL，给药量2 mL/100 g)，下午灌服15%冰乙酸水溶液1 mL，1次/d，连续4 d[5]。末次造模结束后随机分为模型组、阳性组、高良姜高低剂量组、大高良姜高低剂量组、红豆蔻高低剂量组，共9组。

1.2.2 给药方法 造模药物制备：取知母8 kg，加10倍量的纯水浸泡1 h，煮沸后保持微沸1 h，过滤，再加8倍量水煎40 min，过滤，合并2次滤液，加热浓缩至0.5 g/mL生药浓度，静置冷却，保存于4 ℃冰箱备用。冰乙酸溶液制备：取99.5%冰乙酸适量，加纯水稀释成15%冰乙酸溶液。

受试药物制备：取适量高良姜、大高良姜、红豆蔻饮片分别粉碎成粗粉，加入适量石油醚浸泡脱脂12 h，过滤，挥干石油醚，脱脂后粗粉依次加入40倍量95%、60%乙醇回流提取，每次提取时间4 h，提取液过滤，合并所得滤液，减压浓缩，回收乙醇至无醇味。将粗提物加适量的水混匀，煮沸，加入1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至10～11，煮沸1 h，过滤，重复2次，合并滤液，滤液加入1 mol/L盐酸溶液调节pH至1～2，水浴保温30 min，放置24 h，析出沉淀，离心，弃去上清液，沉淀用蒸馏水抽洗2～3次，40 ℃真空干燥，得到3味山姜属中药黄酮提取物[8-9]，备用，用时以0.5%羧甲基纤维素钠溶液配成相应浓度。

阳性药物制备：以0.5%羧甲基纤维素钠水溶液将干姜姜辣素配置成浓度4.5 mg/mL，备用。造模结束后第2天开始给药，空白组和模型组灌服0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，阳性组灌服干姜姜辣素溶液，受试药物给药剂量参考前期研究，以黄酮得率为依据(高良姜、大高良姜、红豆蔻黄酮得率分别为124.1 g/kg、98.1 g/kg、118.5 g/kg)确定[6]。高低剂量分别为临床用量的4倍与16倍，给药体积均为1 mL/100 g，每隔12 h给药1次，共给药4次。

1.2.3 检测指标与方法 大鼠行为体征观察：造模及给药期间，观察大鼠毛发、精神状态，按表1评分并计算平均值；采用电子天平对大鼠体质量、进食量进行称量统计；采用量筒测量统计各组大鼠饮水量；采用电子体温计测定大鼠肛温3次，取3次平均值作为最终测量值。

表1 大鼠毛发及精神状态评分

大鼠血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量测定：末次给药后禁食不禁水12 h，麻醉大鼠，腹主动脉取血，常温放置析出血清，3 000 r/min，离心15 min，分离血清，放入-20 ℃冰箱储存，备用。采用酶联免疫吸附试验法按试剂盒说明测定血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量。

2 结果

2.1 对胃溃疡寒证大鼠行为体征指标的影响 模型组大鼠毛发脏乱，精神状态较差，体质量显著减轻，肛温显著降低，日均进食量、饮水量显著减少，与正常组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.01)。高良姜、大高良姜、红豆蔻高剂量组能显著改善大鼠的毛发与精神状态，升高肛温，与模型组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.05)；低剂量组作用不显著。见表2。高良姜、大高良姜高剂量组大鼠体质量显著增加，与模型组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.05)，低剂量组体质量变化不明显。大高良姜高剂量组、红豆蔻高低剂量组进食量显著增加，与模型组大鼠比较差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)；高良姜高低剂量组对进食量无明显影响。各给药组之间比较，高良姜低剂量组日均进食量与大高良姜组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；大高良姜高剂量组、红豆蔻高剂量组大鼠日均饮水量与高良姜高剂量组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表2 3味山姜属中药黄酮类成分对大鼠毛发及精神状态、肛温的影响

表3 3味山姜属中药黄酮类成分对大鼠体质量、进食、饮水的影响

2.2 对胃溃疡寒证大鼠血清NO、ET、PAF、TXB2、COR含量的影响 与空白组比较，模型组大鼠血清NO含量显著减少，ET、PAF、TXB2、COR含量显著增加，差异均有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较，高良姜高低剂量组、大高良姜与红豆蔻高剂量组大鼠血清NO含量显著升高，差异均有统计学意义(均P<0.01或P<0.05)，大高良姜、红豆蔻低剂量组作用不明显；各给药组大鼠血清ET含量均显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义(均P<0.01或P<0.05)；高良姜与红豆蔻高剂量组、大高良姜高低剂量组大鼠PAF、TXB2含量显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义(均P<0.01或P<0.05)，高良姜、红豆蔻低剂量组作用不明显；高良姜高低剂量组、大高良与红豆蔻高剂量组血清COR含量显著降低，与模型组比较差异均有统计学意义(均P<0.01或P<0.05)，高良姜与红豆蔻低剂量组作用不明显。各给药组之间比较，高良姜、大高良姜与红豆蔻高剂量组NO含量升高明显，差异有统计学意义(P<0.01)；高良姜高剂量组、大高良姜与红豆蔻低剂量组降低ET含量作用显著，与其他给药组比较差异有统计学意义(P<0.05)；大高良姜与红豆蔻高剂量组降低COR含量作用明显，与其他给药组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表4、表5。

表4 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠血清NO、ET、PAF含量的影响

表5 3味山姜属中药黄酮类成分对胃溃疡寒证大鼠血清TXB2、COR含量的影响

3 讨论

胃溃疡属于中医学“胃痛”“胃脘痛”范畴，寒邪客胃型胃脘痛为临床常见证型，需用温中散寒药治疗[10-11]。高良姜、大高良姜、红豆蔻3味山姜属中药药性辛温，归脾胃经，具有温胃散寒的功效，临床常用于治疗寒性胃痛。本研究根据中医药理论、结合临床表现复制胃溃疡寒证模型，以此模型为基础，对3味山姜属中药黄酮类成分的药效与机制进行研究，符合中医“辨证论治”的用药规律及“寒者热之”的治疗原则。胃溃疡临床表现多为上腹部疼痛，患者常见明显的体质量下降，其原因主要为患者为避免进食疼痛，减少进食及饮水[12-13]。寒性胃痛常兼有恶寒蜷卧、食欲不振、饮水少、大便稀溏等症状。本研究根据疾病证候特点，观察大鼠毛发及精神状态，进食、体质量、饮水、体温情况，实验结果表明：给药后大鼠毛发及精神状态改善，进食量、饮水量增加，体质量与体温回升，表明3味山姜属黄酮类成分具有改善胃溃疡寒证大鼠病理状态，恢复正常功能的作用。NO是一种血管活性物质，具有促进胃黏膜血管舒张，增加胃血流量，舒张平滑肌，调节胃黏液分泌及阻止血小板凝集等作用。ET是由血管内皮细胞分泌的断裂多肽，具有血管收缩，紧张平滑肌等作用[14-15]。NO与ET共同调节胃黏膜表皮组织血管紧张性和内皮细胞连续性，有效维持黏膜完整性和黏膜防御功能。NO分泌的降低与ET的升高会直接导致胃黏膜血管通透性降低，胃黏膜血流量减少，增加黏膜损伤，加重溃疡面的生成。PAF主要由体内多种免疫细胞分泌，其受体在胃肠道黏膜及周边血管组织中多有分布，具有降低微血管通透性，减少胃黏膜血流量的作用，PAF的大量分泌会促使胃黏膜细胞代谢发生紊乱，产生胃黏膜损伤[16-17]。TXB2由生成血栓素A2(TXA2)代谢而成，TXA2能够增加血栓形成，导致溃疡面加重。TXA2在人体内代谢极快，不易测定，通过测定TXB2含量可获知TXA2在体内的分泌[18]。COR是由肾上腺分泌的一种肾上腺糖皮质激素，在机体受到刺激后，COR会大量生成，以促进蛋白质分解，加强机体对外界刺激的抵抗力，同时炎症介质表达增加，导致溃疡面愈合缓慢[19-21]。

本研究结果显示，3味山姜属中药黄酮类成分能够增加病证大鼠血清NO含量，降低ET含量，从而降低胃黏膜血管紧张性，增加胃黏膜血流量，维持胃黏膜血管紧张性和通透性，促进溃疡面愈合。通过减少PAF、TXB2、COR的分泌，增加微血管通透性，减少血栓形成，减少炎症介质的产生，维持微血管循环及胃黏膜细胞组织的正常的代谢，促进胃黏膜血流量，增加胃黏膜愈合。本研究结果表明：3味山姜属中药黄酮类成分具有抗胃溃疡寒证作用，其主要通过增加NO含量，降低ET、PAF、TXB2、COR分泌，促进胃黏膜血流量及胃黏膜血循环，改善胃黏膜细胞环境，发挥治疗胃溃疡寒证的作用。3味山姜属中药黄酮类成分的温中散寒药效具有一定的相关性和差异性，表明具有亲缘关系的药物之间活性成分有相似的药效，但作用强弱不同。