长链非编码RNA5（CARLo-5）在食管癌中的表达及临床意义

耿锦楠张雅青张煦 陆滨

1.兰州大学第一医院，甘肃 兰州 730000；2.西北民族大学，甘肃 兰州 730030；3.兰州大学，甘肃 兰州 730000；4.兰州市第二人民医院，甘肃 兰州 730000

食管癌（esophageal carcinoma，EC）是全球范围内常见的恶性肿瘤之一，其发病率在恶性肿瘤中居第九位，病死率居第六位[1-2］，严重威胁人类生命安全。中国是EC高发国家，全球每年约50%的新发EC病例在我国，其中食管鳞癌（esophageal squamous cell cancer，ESCC）是其最常见的病理亚型[3］，约占EC的90%[3，4］。进行性咽下困难是ESCC的典型临床症状，但该病早期进展缓慢，偶有不适感或症状轻重不一，因而发病早期通常无法及时察觉，确诊时多数患者已处于中晚期，肿瘤侵袭转移造成死亡率较高，给患者及其家庭带来沉重负担。因此，有必要探寻一种可用于食管癌早期诊断、靶向治疗、复发监测及预后判断的高效能手段。

近年来，高通量测序技术的发展速度很快，非编码RNA的应用逐渐受到关注。长链非编码RNA（LncRNA）普遍存在于细胞质与细胞核，它是一类长度＞200个核苷酸的RNA，且无法编码蛋白质[5］。有证据表明LncRNA具有广泛的生物学作用，其异常表达可能与多种恶性肿瘤的发生、发展密切相关[6］，但现阶段人们对LncRNA的具体机制及相关功能所知甚少。癌症相关区域长链非编码RNA5（CARLo-5）最初发现于结肠癌中，后陆续发现其高表达于肝癌、肺癌等恶性肿瘤[7］，但其在EC组织中表达及临床意义的研究报道较少。本研究采用Realtime-PCR法检测患者癌组织及对应癌旁组织标本CARLo-5表达水平，分析CARLo-5在EC组织中的表达情况及其与EC患者临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年3月至2016年10月行食管癌根治术的食管癌患者58例，每例患者均取癌组织及非癌组织（距癌组织＞5cm）标本，上述标本均有详细完整的临床资料及组织病理诊断。采集标本后存于离心管中（无RNA酶），置-80℃冰箱保存。58例患者中男性41例，女性17例，年龄42～78岁，平均（59.87±8.76）岁。参照2017年国际抗癌联盟（union for interna tional cancer control，UICC）和美国癌症联合会（American joint committee on cancer，AJCC）发布的食管癌TNM分期标准（第8版）进行分期，依据世界卫生组织（WHO）病理分级标准[8］确定分化程度（1级：高度分化；2级：中度分化；3级：低度分化）。

1.2 纳入与排除标准

1.2.1 纳入标准。①术后病理证实为食管鳞癌，均行根治性切除术；②均为原发性食管鳞癌，术前未行放化疗；③本研究经兰州大学第一医院医学伦理委员会批准；④标本采集获得患者及家属同意，均签署知情同意书。

1.2.2 排除标准。①心、肝、肾等重要脏器功能不全者；②合并自身免疫疾病或精神疾病者；③食管腺癌（EAC）或并发其他恶性肿瘤者。

1.3 主要仪器及试剂 光学显微镜（日本OLYMPUS公司，BX41型）、倒置相差显微镜（日本Niko公司，TS100型）、生物安全柜（山东济南鑫贝西公司，BSC-1500ⅡA型）、PCR仪（美国ABI公司，ABI5700型）、Realtime-PCR（Applied Biosystems公司，7500型）、高速低温离心机（TTICH-400型）、无菌培养瓶（美国Costar公司）、TRIzolR试剂（美国Invitrogen Life Technologies公司）、SYBR Real-Time PCR试剂盒（美国Thermo公司）、反转录试剂盒（美国Invitrogen公司）、细胞裂解液（北京索莱宝科技有限公司）、PCR引物（上海生工技术有限公司）等。

1.4 检测方法 ①总RNA提取及鉴定：a.实验前制冰，以离心机预冷20min；固体组织置于培养皿，以手术剪剪成小块（约3mm×3mm）后置于研磨器中，加入TRIzol裂解液，充分研磨后将组织匀浆液移至1.5mLEP管；加200μL氯仿至EP管，手动震荡12s，后冰上静置10min，4℃下12000rpm离心30min；吸取无色液相置入新EP管（取上层，500μL即可），后加异丙醇500μL，混匀后冰上静置10min，4℃下离心30min；弃上清见RNA沉入管底，加75%乙醇1mL至EP管中后温和震荡，使RNA再度悬浮，4℃下离心5min；弃上清，以枪头吸取剩余乙醇，室温下晾干；RNA沉淀与焦碳酸二乙酯（DEPC）水相溶后，-80℃下保存待用。b.RNA检测：以0.1%DEPC水调零检测仪，取1μL RNA稀释液测定浓度、纯度，A260/A280介于1.8～2.0时视为纯度合格，无污染。即刻读取浓度，其浓度介于500～1000ng/μL间最为适宜，酌加0.1%DEPC水调整。②Realtime-PCR法检测CARLo-5表达水平：a.反转录合成cDNA：采用反转录试剂盒完成RNA至cDNA制备，于-20℃下保存备用；b.PCR扩增：PCR引物：设计合成后引物呈粉末状，以离心机高速离心，参照摩尔数适量添加DEPC水，配制储存液（浓度为100mmol/L）后保存，工作液浓度10mmol/L，引物序列见表1；PCR反应条件：CARLo-5/GAPDH：95℃预变性5min，设定循环参数（95℃15s、60℃30s、72℃30s，共40次），72℃延伸5min。c.目的基因鉴定：取DNAladder、目的基因PCR扩增产物各5μL，以GAPDH基因为内参照，分析灰度值比或以2-ΔΔCT表示各目的基因相对表达量。根据EC组织中CARLo-5相对表达倍数（癌/癌旁组织）之中位数分化低表达组（癌/癌旁组织＜2.80，24例）和高表达组（癌/癌旁组织＞2.80，34例）。以EC组织中CARLo-5相对表达量平均数4.25为分界点，分为CARLo-5高表达组和低表达组。

表1 引物序列及扩增条件

1.5 随访 以门诊和电话随访等方式开展术后随访，随访截止日期为2019年11月10日。以手术开始至死亡或末次随访时间定义总生存期（overall survival，OS），分析其术后生存情况。

1.6 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件分析数据。计量资料采用（±s）表示，以独立样本t检验；计数资料以%表示，予χ2检验；以COX分析法分析影响EC患者生存情况的相关因素，以Kaplan-Meier曲线分析生存情况，组间行Log-Rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EC组织及癌旁组织中CARLo-5表达水平比较Realtime-PCR检测结果显示，EC组织中CARLo-5相对表达量上调（4.25±9.02）明显高于配对癌旁组织（1.09±0.95），差异有统计学意义（t=2.653，P＜0.05）。见图1，2。

图1 LncRNA CARLo-5在食管癌和癌旁组织中的表达水平

2.2 CARLo-5与EC患者临床病理特征的关系 食管癌组织中CARLo-5表达与患者年龄、性别、肿瘤分化程度、位置和大小无关（P＞0.05），与肿瘤TNM分期、淋巴结转移情况有关（P＜0.05）。见表2。

表2 CARLo-5与EC患者临床病理特征的关系（例）

2.3 EC患者CARLo-5表达与生存情况的关系CARLo-5高表达组生存率显著低于CARLo-5低表达组（χ2=6.941，P＜0.05，高表达组平均生存期为（24.39±1.68）月，低表达组平均生存期为（31.42±1.48）月，高表达组生存期显著短于低表达组（t=2.653，P＜0.05）。见图2。

图2 EC患者CARLo-5表达与生存情况的关系

2.4 EC患者OS影响因素的Cox分析 单因素分析显示TNM分期、淋巴结转移、CARLo-5表达水平为影响EC患者OS的危险因素（P＜0.05）。见表3。COX多因素回归分析显示淋巴结转移、CARLo-5表达水平是影响OS的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

表3 影响EC患者OS的单因素分析

表4 影响EC患者OS的Cox多因素回归分析

3 讨论

EC主要有ESCC和EAC两种组织学形式，前者多因食管鳞状上皮细胞不典型增生演变发展而来，后者则由食管下段复层上皮缓慢演变或肠上皮细胞化生而来，近年来其发生率呈不断升高态势。我国北方地区是EC高发地区，其中主要为ESCC。据报道[9-10］，与EC死亡相关病例约50%以上发生于中国，防治形势十分严峻。

近年来，转录组学及高通量测序技术的研究获得较大进展，人们发现绝大多数基因被转录成ncRNA，且上述基因在漫长的生物进化过程中得以保留，这对传统基因表达及调控模式提出了新的挑战。现有研究证实转录成LncRNA的ncRNA占76%[11-12］，且具备组织特异性，能在表观遗传调控中发挥关键性作用[13］。随着临床研究的进一步深入，越来越多的学者发现LncRNA异常表达于多种恶性肿瘤，可同时作为癌基因或抑癌基因，并参与肿瘤的发生发展过程，被认为是相关肿瘤潜在的诊断、预后判断标志物乃至治疗靶点[14］。EC的发病机制目前仍未完全阐明，其发展过程同时也是一种复杂的生物学过程，遗传及表观遗传学被认为参与了该病的发生发展。现有研究证实LncRNA与EC的发生发展密切相关，其中HOX转录反义RNA被证实在绝大多数ESCC中呈异常表达，是癌细胞侵袭及转移能力得以增强的重要驱动因素，同时也是影响患者预后的独立危险因素[15］。

CARLo-5是一种近年来研究较多的LncRNA，相继被学者发现在结直肠癌、肝癌、肝内胆管癌、肺癌等多种恶性肿瘤中呈高表达。管群等[16］指出，CARLo-5在子宫内膜癌组织中表达水平异常升高，与肿瘤分期、淋巴结转移和患者预后密切相关。Dou C等[17］经研究发现，CARLo-5可作为肝癌治疗的新靶点，该基因敲除能明显抑制肿瘤生长。本研究采用Realtime-PCR检测58例EC组织及癌旁组织CARLo-5情况，结果显示EC组织中CARLo-5表达水平明显高于癌旁组织，提示EC组织中CARLo-5表达上调。进一步研究发现CARLo-5表达与TNM分期、淋巴结转移有关，其高表达多见于TNM分期Ⅲ、Ⅳ期患者和淋巴结转移患者中，推测其可能在该病发生发展过程中发挥重要作用，随着EC患者病情进展CARLo-5表达量亦随之升高，这与管群等[16］关于CARLo-5在子宫内膜癌中表达情况的相关研究结论一致。但EC组织中CARLo-5表达上调的具体机制及生物学功能尚不明确，可能与CARLo-5能抑制细胞凋亡、诱导EC细胞增殖有关。研究认为[18］，癌症的易感性增加与CARLo-5的表达水平有关，推测其可能在肿瘤发生及进展中起一定作用。此外，本研究经随访发现CARLo-5高表达组患者的生存率及生存期均较低表达组差，提示CARLo-5高表达可能与EC患者预后相关，可能在预后评估中有重要价值。同时，本研究发现单因素及Cox多因素回归分析结果显示淋巴结转移、CARLo-5表达水平是影响OS的独立危险因素，这进一步揭示CARLo-5表达可能在EC患者预后评估中有一定价值。

综上所述，CARLo-5在食管癌组织中较癌旁组织显著上调，其表达与TNM分期、淋巴结转移等临床特征有关；淋巴结转移、CARLo-5表达水平是影响食管癌患者生存的独立危险因素，其中CARLo-5表达水平可能与食管癌发生发展有一定关系，并可能成为该病预后评估的重要生物标志物。本研究主要存在以下不足：①仅纳入58例EC患者，样本量较少，后期需扩大样本量进一步证实CARLo-5在EC患者中的临床价值；②癌组织中CARLo-5表达上调的具体机制仍有待进一步研究。目前对于LncRNA的功能人们仍所知有限，全基因组研究发现LncRNA是一种具备复杂调控机制的分子，其可能延伸范围目前尚不确定。尽管LncRNA无法编码蛋白质，但可向下游传递相关信息，并在调控基因表达方面发挥重要作用，因而作为一种信息传导分子其在疾病诊治方面可能较传统意义上的蛋白质更具特异性和敏感性。目前LncRNA及CARLo-5的研究尚处于初始阶段，相信随着相关研究的进一步深入，人们会逐步揭示CARLo-5等LncRNA与食管癌以及其他恶性肿瘤发生发展的关系，并逐渐加深理解和认识，最终在食管癌等恶性肿瘤的诊断和治疗中发挥其作用。