云南蒙自甜石榴皮多酚提取工艺及多酚含片配方优化

李建飞 李明明 招艳怀 何斗车 黄业伟 朱强强

（1.云南农业大学/普洱茶学教育部重点实验室 云南昆明 650201；2.云南农业大学食品科学技术学院云南昆明 650201；3.云南农业大学理学院 云南昆明 650201）

石榴（Punica granatumL.），又名安石榴、若榴，为石榴科石榴属灌木或乔木，被子植物，主要分布在亚热带及温带地区，在我国多地均有种植，属浆果类水果，营养丰富[1-2]。石榴果皮中含有大量的多酚[3]，包括鞣花酸、没食子酸、儿茶素、儿茶酚、绿原酸等[4-5]，有抗菌[6-7]、抗癌、缓解人体氧化和衰老、增加皮肤滋润度、抑制血压升高、促进伤口愈合、治疗腹泻[8]、促进消化吸收[9]、治疗和缓解口腔溃疡[10-11]等功效。王彩云等[12]研究表明，长期大量饮用石榴汁（含有丰富的多酚）不会产生毒害作用，说明食用石榴皮多酚比较安全，可进一步的开发食用产品。

石榴皮多酚提取的工艺方法主要有溶剂提取法、微波辅助提取法、超声波辅助提取法和超临界流体萃取法等[13-15]，但是，这些提取方法提取时间较长、溶剂使用量大、提取温度高、设备要求高等缺点，不利于实际应用。目前研究中，石榴皮多酚短时高效提取依然是其研究方向，短时高效提取方法的提取率及最优提取工艺依然未能确定，需要进一步探究石榴多酚的最佳提取工艺。

云南蒙自是云南省重要的石榴产地，石榴产量高且当地石榴产品主要以鲜食为主，目前鲜果产品面临种植成本提升和产品价格不断下降的影响，农民获得利润逐渐降低。蒙自地区石榴深加工能力不足，产品与国内其他地区类似，多为粗加工产品，对石榴及其果皮的深加工程度不高，产品附加值低[16]，亟需创新发展多种形式新产品、新用途。本研究在多酚粗提取及下游产品开发上进行研究，提出石榴皮副产品使用新方向，有助于延长石榴产业链，把蒙自石榴资源优势转化为产业优势，持续为云南乡村振兴战略发挥作用。

本研究通过优化石榴果皮的多酚提取工艺及石榴多酚的产品开发，获得一种多酚提取工艺及产品优化配方，可为云南石榴产业的精深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试材云南蒙自甜石榴购自云南蒙自，为市售。

1.1.2 仪器与设备DHG-2150B 电热恒温鼓风干燥箱（郑州生元仪器有限公司）；YB-150 粉碎机（永康市速锋工贸有限公司）；AX223ZH/E 电子天平（奥州斯仪器（常州）有限公司）；KQ3200E超声清洗机（昆山市超声仪器有限公司）；SF-TDL-4A 离心沉淀器（上海菲洽尔分析仪器有限公司）；UV-1800PC 分光光度计（上海菁华仪器有限公司）；TDP-1.5T 型单冲压片机（广州市旭朗机械设备有限公司）。

1.1.3 试剂石榴多酚（食品级，陕西森悦生物科技有限公司）；淀粉（食品级，云南云钟工贸有限公司）；白砂糖（食品级，云南滇王驿农业科技开发有限公司）；VC（食品级，华中药业股份有限公司）；麦芽糊精、硬脂酸镁、三氯蔗糖（食品级，河南万邦化工科技有限公司）；无水乙醇（分析纯，重庆万盛川东化工集团有限公司）、没食子酸（分析纯，纯度>98%，天津市鼎盛鑫化工有限公司）、福林酚试剂（分析纯，南京奥多福尼生物科技有限公司）、10%无水碳酸钠（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 石榴预处理蒙自甜石榴人工去皮，清洗果皮后放至70℃烘箱中干燥7 h，粉碎后，将粉末密封于包装袋中保存，置于干燥、避光的环境中，备用。

1.2.2 技术路线石榴皮干燥后再进行提取有助于提高提取率，超声助溶可减少提取时间[15，17-18]，石榴皮多酚提取工艺如图1 所示。

1.2.3 含片制作工艺流程含片的制作工艺成熟，配制合适的配方后即可压片成型[19-20]，本研究构建的含片工艺流程见图2，用于含片制作和后续感官评价。

1.2.4 总多酚提取、测定、计算称取2 g 石榴皮粉，按照料液比加入乙醇溶液，混合后使用100 W的超声波进行超声助溶10 min，4 000 r/min 离心20 min 后收集上清液，过滤定容[20-22]，选择福林酚比色法来对石榴皮总多酚进行测定[16-18]。吸取1 mL 石榴皮多酚提取液，超纯水稀释20 倍于容量瓶中，后吸取1 mL 的福林酚试剂，0.5 min 之内快速加入3 mL 10%无水碳酸钠溶液，摇晃混合、定容。室温避光反应30 min，以0.008、0.016、0.024、0.032、0.040 mg/mL 没食子酸的标准溶液为对照，672 nm 波长下测定吸光度，建立标准曲线，回归方程Y=19.225X–0.0408，相关系数r2=0.999 8，在此基础上根据公式（1）计算多酚提取量[23]。

式中，P为多酚提取含量（mg/g）；N为提取液稀释倍数；A为吸光值；V为加入的提取液的体积（mL）；M为石榴皮粉的质量（g）。

1.2.5 石榴多酚含片辅料处理、筛选、压片三氯蔗糖、白砂糖作为甜味剂，麦芽糊精作为粘合剂，硬脂酸镁作为赋形剂，用VC 丰富含片的口感。选用具有疏水性的淀粉增加光滑性。依照国家添加剂使用标准[23]限量添加。白砂糖充分研磨为粉末，辅料充分混合，及时压片。

1.2.6 提取工艺及含片配方参数优化在提取工艺研究中，以多酚提取量为响应值，选择乙醇浓度、料液比、提取时间及提取温度4 个变量进行单因素试验[24-26]，选择4 因素3 水平正交试验（表1），进行最优配比的探索。

表1 多酚提取正交实验因素水平设计表

（1）乙醇浓度 称取5 份2 g 石榴皮粉末于离心管中，分别加入70%、60%、50%、40%、30%乙醇溶液，按料液比1∶5（g/mL）混合。40℃、100 W 超声助溶10 min，4 000 r/min 离心20 min，收集上清液并过滤，根据1.2.4 计算总多酚的含量。

（2）料液比 称取5 份2 g 的石榴皮粉于离心管中，加入50%的乙醇溶液溶解，料液比按1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25（g/mL）添加。40℃、100 W 超声助溶10 min，4 000 r/min 离心20 min，收集上清液并过滤。根据总多酚的含量测定方法，根据1.2.4 计算总多酚的含量。

（3）提取时间 称取5 份2 g 的石榴皮粉于离心管中，加入50%的乙醇溶液按1∶5（g/mL）的料液比溶解，超声助溶时间梯度为10、20、30、40、50 min，40℃、100 W 超声，4 000 r/min 离心20 min，收集上清液并过滤。根据总多酚的含量测定方法，于672 nm 下测吸光度值。

（4）提取温度 称取5 份2 g 的石榴皮粉于离心管中，加入50%的乙醇溶液按1∶5（g/mL）的料液比溶解，提取温度梯度为20、30、40、50、60℃，100 W 超声助溶10 min，4 000 r/min 离心20 min，收集上清液并过滤。根据总多酚的含量测定方法，根据1.2.4 计算总多酚的含量。

（5）石榴多酚 石榴多酚添加量分别为1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 g，添加VC 0.2 g，淀粉5.1 g，白砂糖3.5 g，麦芽糊精1.5 g，三氯蔗糖0.007 g，硬脂酸镁0.1 g，混匀压片，感官评定。

（6）淀粉 淀粉添加量分别为5.0、5.1、5.2、5.3、5.4 g，添加石榴多酚1.5 g，VC 0.2 g，白砂糖3.5 g，麦芽糊精1.5 g，三氯蔗糖添加0.007 g，硬脂酸镁添加0.1 g，混匀压片，感官评定。

（7）白砂糖 分别添加白砂糖3.3、3.4、3.5、3.6，3.7 g，添加固定石榴多酚1.5 g，VC 0.2 g，淀粉5.1 g，麦芽糊精1.5 g，三氯蔗糖0.007 g，硬脂酸镁0.1 g，混匀压片，感官评定。

（8）含片配方优化在含片制作配方优化中，选择石榴多酚添加量、淀粉添加量、白砂糖添加量进行单因素试验[26-28]，通过感官评定[29]（表2），选择3 因素3 水平进行正交试验（正交试验设计见表3）。

表2 石榴多酚含片感官评定指标

表3 石榴多酚含片配方正交试验因素水平表

1.2.7 含片质量要求随机抽取10 片含片，称重。根据《中国药典》[30]中含片要求，重量差异限度1 倍范围为合格品，其他为次品。

1.2.8 数据处理所有试验平行测定3 次，单因素实验结果用Graph Pad 5 作图，用SPSS 22 软件进行正交分析，以p<0.05 表示有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素对石榴皮多酚提取量的影响

石榴皮多酚提取量随着乙醇浓度升高逐渐升高，并在60%时多酚提取量较高（8.53 mg/g），且与其他组显著差异（p<0.05）；随后乙醇浓度的继续升高，多酚含量下降（图1-A），这可能是提取溶剂乙醇与石榴皮多酚之间的极性差异增大，致使提取率降低引起的[13]；70%时多酚提取降到5.86 mg/g。综上，选用50%、60%、70%的乙醇浓度进行进一步的正交试验优化。

料液比在1∶10（g/mL）条件下，获得最大多酚提取量8.248 mg/g，与其他组相比具有显著差异性（p<0.05，图1-B）。料液比的提高有助于增加石榴皮粉末与溶液之间的接触面积，增加提取量[31]，但料液比达到一定比例后，多酚在溶液中的扩散达到最大值，增加溶液体积不会进一步增加提取量，甚至会稀释多酚的提取浓度[31-32]，降低提取量。本研究也发现，较高的料液比会降低多酚提取量，因此，选用料液比1∶5、1∶10、1∶15（g/mL）进行进一步的正交试验优化。

提取时间在30 min 时，获得较高的多酚提取量，达到5.45 mg/g（图1-C），与其他时间点相比具有显著性差异（p<0.05）。但是随着提取时间的延长，多酚提取量会下降，这是由于长时间提取会导致多酚发生氧化、聚合等反应会破坏总多酚物质结构，导致提取量减少[33]。因此，选用提取时间20、30、40 min 进行进一步的正交试验优化。

随着温度的提高，石榴多酚的提取量逐渐增高，在30℃时达到相对高点，含量为6.92 mg/g（图1-D）；随着温度升高，多酚含量维持较高的水平，40 和50℃提取量均值分别为6.77 和6.75 mg/g，与30℃提取相比无显著差异(p>0.05)，但是与20℃相比均具有显著差异性(p<0.05)。较高温度会导致多酚结果破坏[34]，减少多酚提取量。本研究也发现，60℃时多酚提取量显著下降，因此结合提取率的差异性，选用提取温度30、40、50℃进行进一步的正交试验优化。

2.2 石榴皮多酚提取工艺正交试验优化

由表4 中极差R值可知，4 个因素对多酚提取量的影响排序是D>A>B>C；正交试验结果发现，最优组合为A2B3C1D2，石榴皮总多酚提取量为8.331 mg/g；通过优化验证实验，按A2B2C1D2的提取工艺与试验最优组（6 号，A2B3C1D2）进行验证对比，A2B2C1D2提取工艺的总多酚提取量为8.59 mg/g，优于6 号组合。根据正交试验结果，确定石榴皮多酚的提取优化工艺为提取温度30℃、提取时间30 min、料液比1∶10（g/mL）、乙醇浓度 60%，所得的石榴皮总多酚含量为8.59 mg/g。

表4 正交试验结果

2.3 单因素对石榴多酚含片工艺的影响

多酚含量对感官评分具有显著影响，过低会造成无多酚口感，评分较低（<60）；过高又会苦味浓，评分低于70；当石榴多酚添加量为1.4 g有较好的口感，感官评分与其他各组相比具有显著性差异（p<0.05），故选用多酚添加量1.3、1.4、1.5 g 进行进一步的正交试验优化。

淀粉量添加对含片的口感影响较大，随着淀粉添加量的增加，感官评分呈现先高后低的现象，且在淀粉添加量为5.1 g 时，感官评分最高，均值在78 分，与其他组别有显著性差异(p<0.05)，故选用淀粉添加量5.0、5.1、5.2 g 进行进一步的正交试验优化。

随着白砂糖添加量增加，感官评分呈现先升高后降低，添加较少口味偏苦，评分均值在70；添加过多会造成甜度过高，遮盖多酚味道，评分也较低（<70）；当白砂糖添加量为3.5 g 时，获得较高的感官评分（均值82），与其他组有显著性差异(p<0.05)，故选用白砂糖添加量3.4、3.5、3.6 g 进行进一步的正交试验优化。

2.4 含片配方最佳工艺的确定

通过正交试验极差分析（表5）可知，石榴多酚添加量、淀粉添加量、白砂糖添加量这3 个因素对含片质量影响力顺序为：c>a>b。正交试验感官评分显示，a2b3c1组合具有较高的感官评分，均值达到89.11，通过正交试验结果分析，获得多酚含片最优工艺配方为石榴多酚1.4 g、淀粉5.2 g、白砂糖3.4 g，得到的含片片剂完整，表面光滑，口感细腻，甜味合适，苦味适中，且有回甘。

表5 石榴多酚含片配方感官评定表

2.5 含片质控

随机从最优配方制作的含片中抽取10 片，称出重量，总重为3.396 g，平均片重为0.340 g。根据《中国药典》相关规定，重量差异限度1 倍范围得到0.289<0.340<0.390 g，说明含片大小基本一致，片剂之间重量差异较小，为合格品。

3 讨论与结论

本研究充分利用云南特色水果资源——蒙自石榴，采用废弃石榴皮作为原料，通过探究石榴皮中提取多酚的工艺并进行了优化，获得了一种较优的石榴皮多酚提取工艺，所得的石榴皮总多酚含量为8.591 mg/g。在此基础上，本研究优化了石榴多酚含片的配方，得到一种甜味、苦味适中的含片配方。

石榴皮中多酚的提取可减少资源浪费，促进石榴综合利用。本研究从料液比、温度、乙醇浓度、提取时间4 个因素入手，探索影响石榴皮多酚提取的4 个因素，确定了一种较优的提取工艺，这些提取因素与其他研究报道相似，说明本研究在影响多酚提取的因素选择上具有代表性。穆谈航等[28]的研究结果与本研究相似，料液比一致，获得的多酚提取量相近，但是其提取时间为40 min，较本研提取时间30 min 更长。吴琳等[13]的研究与本研究相比，其提取率未有较大提高，但是其提取过程使用的料液比较大，提取温度（50℃）更高和时间（2 h）更长，相比之下，本文进行的提取研究经济性更好。

石榴多酚的综合利用是提高其附加值的重要手段，石榴多酚乳膏、抗老化和衰老类化妆品等产品已经被研发或进入市场销售。本研究从食品角度入手，开发了一种含石榴多酚的含片产品，与化妆品类产品相比，生产成本低廉，更容易进入大众消费市场。相关报道[35]称，多酚可以增加肠道菌群的均匀性和丰富度，调节菌群结构，提高益生菌相对丰度。可以预见，食用石榴多酚含片类产品在调节肠道微生物菌群变化方面具有一定的应用价值。