Lupalbigenin 抑制Ba/F3 EGFR WT 野生型肺癌细胞增殖作用机制

杨星莹 朱威巍 江丽 爨向丹 盛军 黄艳苹1,

（1.云南农业大学/普洱茶学教育部重点实验室 云南昆明 650201；2.云南农业大学食品科学技术学院 云南昆明 650201；3.云南农业大学理学院 云南昆明 650201；4.云南省高原特色农业产业研究院 云南昆明 650201）

肺癌是目前恶性肿瘤死亡的首要原因[1]，在肿瘤治疗中备受关注。肺癌又被分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌，其中非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）约占肺癌总数的85%以上[2]。非小细胞肺癌分为肺腺癌、鳞状细胞癌（SCC）和大细胞肺癌（LCC）的组织学亚型，以上病症每年造成150 多万人死亡[3-4]。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）属于人表皮受体酪氨酸激酶家族的一员，该家族还包括人表皮生长因子受体 2、3、4[HER2/neu（ERBB2），HER3（ERBB3）和HER4（ERBB4）]3 个成员[5-6]。EGFR 参与调节多种细胞生命过程，如增殖、分化、存活等[7]。EGFR主要包括4 个部分：胞外配体结合域、跨膜域、酪氨酸激酶域和C 端尾[8]。当EGFR 与配体（EGF）结合后，胞内的酪氨酸激酶域会发生动态构象变化，通过首尾相连的方式形成不对称二聚体，使胞内C 端酪氨酸激酶残基发生磷酸化[9]。肺癌患者具有极低的存活率[10]，科学家们在这些患者的肺癌肿瘤中发现EGFR 的表达量明显高于常人[11]。因此靶向EGFR 治疗非小细胞肺癌具有重要意义。

本实验所用化合物Lupalbigenin（LG）是一种类黄酮天然化合物。已有文献报道，从Derrisscandens中分离出的LG 可以诱导乳腺癌细胞系发生死亡[12]。Ausawasamrit 等[13]发现，LG可以通过影响蛋白激酶B（AKT）和细胞外调节蛋白激酶（Erk）的磷酸化来诱导肺癌细胞发生凋亡。还有研究报道，LG 通过下调炎症基因和蛋白表达来抑制NF-κB 信号的传导[14]。根据前人LG在癌症和炎症治疗方面的相关研究，本研究对LG抑制EGFR 野生型肺癌细胞增殖作用机制进行研究。构建Ba/F3 EGFR WT 细胞并经过单克隆、流式细胞术、Western blot 检测EGFR 表达量，通过MTS 法筛选出化合物LG，使用LG 处理细胞，从细胞存活率、细胞形态、细胞凋亡情况、周期阻滞情况、信号通路转导变化方面阐述LG 抑制Ba/F3 EGFR WT 肺癌细胞增殖作用机制。验证LG是否能抑制Ba/F3 EGFR WT 细胞增殖，并且在EGF 存在时依旧能抑制细胞存活，以期为治疗EGFR 野生型非小细胞肺癌患者提供新的基础研究理论，同时为天然化合物治疗人类疾病提供相关依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用化合物LG，分子式C25H26O5，纯度99%，购于云南西力生物技术股份有限公司，其结构式如图1 所示。实验用细胞Ba/F3 购于美国典型培养物保藏中心（Manassas，VA，USA），并在含有10% FBS、1% P/S 和5%白介素3（IL3）的1640 培养基中于37℃下在含5% CO2的细胞培养箱中进行培养（BINDER；Tuttlingen，Ger-many）。实验用抗体购于Cell Signaling Technology 公司。

1.2 方法

1.2.1 试验设计将EGFR WT 质粒转化入大肠杆菌中扩大培养，使用无内毒素大提质粒试剂盒提取质粒测定浓度后，使用电转染将质粒导入Ba/F3 细胞。经过转化实验、抗生素筛选、单克隆实验得到高表达EGFR 的Ba/F3 EGFR WT 野生型肺癌细胞。使用MTS 法筛选化合物LG，再确定有效浓度，选取2 个有效浓度分别联合EGF 处理Ba/F3 EGFR WT 细胞。试验设6 个处理组：对照组，Control；EGF 组：EGF；5 µmol/L 的LG组，LG 5 µmol/L；5 µmol/L 的LG 联合应用EGF组，LG 5 µmol/L+EGF；10 µmol/L 的LG 组，LG 10 µmol/L；10 µmol/L 的LG 联合应用EGF 组，LG 10 µmol/L+EGF。依次检测6 个处理组细胞存活率、细胞状态、EGFR 信号转导变化、凋亡水平和周期阻滞情况。

1.2.2 细胞培养与传代当细胞单层布满细胞培养瓶时，在超净工作台中，用移液器吹匀细胞后取出转移至离心管中1 000 r/min 离心3 min，弃上清。加入无菌、预热的PBS 吹匀洗涤，1 000 r/min 离心3 min，弃上清后加入完全培养基轻吹混匀细胞，分别移入两个T25 细胞培养瓶中，补充适量相应的完全培养基观察状态后置于37℃恒温培养箱中培养。

1.2.3 质粒提取将质粒转化入大肠杆菌；添加适量抗生素培养筛选并扩大培养目的菌种，收集离心后，使用无内毒素质粒大提试剂盒提取目的质粒，使用分光光度计测定质粒浓度，保存质粒备用。

1.2.4 细胞转染收集状态良好的Ba/F3 细胞，经过计数计算使用转染试剂盒中的T Buffer 将细胞Ba/F3 密度调整为5×107个/mL，并按照比例与质粒混合，电转枪取一枪细胞密度为 5×106或2×106个/100 µL。在电转杯内加入3 mL E Buffer。通过NeonTM电转染系统选择合适程序将质粒导入细胞内。转染完成的细胞用新鲜1640 培养基（含有10% FBS）混匀，细胞培养箱培养24 h 后加入筛选抗生素扩大培养。

1.2.5 细胞筛选细胞转染24 h 之后，将细胞培养基替换为完全培养基（含有10% FBS，1% P/S）。48 h 后加入嘌呤霉素，正常进行细胞传代与换液。

1.2.6 细胞单克隆取状态稳定的转染细胞离心后，重悬、计数，96 孔板接单克隆，保证每个孔0.5 个细胞。混匀含有细胞的混合液，用排枪将细胞液转移到96 孔板中，每孔200 µL，周围用无菌PBS 填充。置于37℃细胞培养箱培养10 d，在显微镜下逐孔观察，将单一细胞团转移到小皿中，根据细胞生长状态及密度逐步扩大培养。

1.2.7 MTS 检测细胞增殖将细胞密度调整为每100 µL 5×104个细胞，用无酚红1 640 培养基混匀，接种于96 孔板中，恒温培养箱静置4 h；再加入含有药物的培养基 100 µL/孔，总体积200 µL/孔，置于37℃培养箱处理48 h；加入MTS溶液，20 µL/孔，避光孵育3～4 h，震荡5～10 min充分溶解结晶物。将96 孔板放于酶标仪中，在492 nm 处读取细胞的吸光值。

1.2.8 细胞蛋白表达检测

（1）细胞蛋白提取 取经过药物处理的细胞1 000 r/min，离心3 min，弃上清；冰PBS 清洗一遍离心后弃上清，加入高效裂解液（PMSF:RIPA高效裂解液=1∶100），冰上裂解30 min，放入4℃离心机，15 000 g，离心20 min，吸出上清，放于冰上备用。

（2）蛋白浓度测定 37℃恒温孵育30 min，使用多通道酶标仪测定吸光度，测定波长分别为560 和630 nm，测定数值均扣除空白孔吸光值，代入计算公式得到样品蛋白浓度。

（3）蛋白电泳与转膜 将蛋白样品按顺序依次加入凝胶泳道，电泳第一阶段电压为50 V，待蛋白跑出浓缩胶后增加电压至120 V，根据目的蛋白分子量调节第二阶段时间。将分离胶与甲醇激活的PVDF 膜帖在一起，放入转膜夹中卡入转膜槽，设置电流为200 mA，转膜时间为60 min。

（4）化学发光 配制化学发光液（A∶B=1∶1），混匀，将膜与发光液充分接触，点击“Expose”开始曝光。曝光时间根据出现条带的曝光程度自动选择曝光停止时间，曝光停止后选择合适的图片拷贝。

1.2.9 数据分析与统计采用SPSS 17.0 软件进行显著性分析[（mean+SEM），one-way ANOVA]，*p<0.05 为差异显著，**p<0.01 为差异有明显显著，***p<0.001 为差异极显著。使用GraphPad Prism8 作图软件，对实验数据进行作图。细胞存活率=[（As–Ab）]/[(Ac–Ab)]×100%，As：验孔吸光度；Ac：对照孔吸光度；Ab：空白孔吸光度。细胞抑制率=1–细胞存活率。

2 结果与分析

2.1 稳定表达EGFR 细胞株构建

通过电穿孔转染法成功构建 Ba/F3 EGFR WT 细胞，该细胞可脱离IL3 独立生长。通过流式细胞技术对单克隆细胞EGFR 表达水平进行检测，如图2-a 所示，EGFR 表达量为98.04%。同时利用Western blot 检测Ba/F3 细胞和Ba/F3 EGFR WT 细胞的EGFR 蛋白表达水平。结果如图2-b 所示，Ba/F3 EGFR WT 细胞高表达EGFR蛋白，因此细胞系构建成功，可以进行后续实验。

2.2 MTS 法筛选化合物并确定有效浓度

基于云南农业大学普洱茶教育部重点实验室化合物库中的天然化合物选择5 种化合物见表1，浓度5 µmol/L，在Ba/F3 EGFR WT 细胞上使用MTS 法进行筛选。其中Lupalbigenin（LG）能够抑制Ba/F3 EGFR WT 细胞增殖，如图3-a 所示，LG 将Ba/F3 EGFR WT 细胞存活降低至50%以下，如图3-b 所示，并且随着LG 浓度的升高细胞存活逐渐降低。

表1 化合物信息

2.3 LG 改变Ba/F3 EGFR WT 细胞形态

LG 处理Ba/F3 EGFR WT 细胞15 h 后其细胞形态如图4 所示。可以看出，Ba/F3 EGFR WT 细胞形态发生明显变化。对照组的Ba/F3 EGFR WT细胞形态圆润透亮有光泽，在培养液中下层且生长密集。处理组（LG 10 µmol/L+EGF）细胞状态明显改变，体积明显缩小、细胞膜破裂呈碎片、呈不透亮的状态。

2.4 LG 对Ba/F3 EGFR WT 细胞EGFR 信号通路的影响

经过1 h 的处理后，LG 10 µmol/L+EGF 组显著抑制Ba/F3 EGFR WT 细胞EGFR 相关蛋白磷酸化表达，降低了P-EGFR、P-Erk、P-Gsk-3β和P-S6蛋白表达水平（图5）。表明10 µmol/L 的LG 可以抑制EGFR 下游信号通路转导，并且在EGF 存在时也有抑制效果。

2.5 LG对Ba/F3 EGFR WT细胞凋亡率的影响

经过15 h 的处理后，EGF 组凋亡率低于对照（Control），LG 10 µmol/L 凋亡率最高。LG 10 µmol/L+EGF 组凋亡率有所回升，但也高于对照组（Control）、EGF 组和两个低浓度组（LG 5 µmol/L 和LG 5 µmol/L+EGF）（图6）。表明10 µmol/L 的LG 可以增加Ba/F3 EGFR WT 细胞凋亡率。

2.6 LG 对Ba/F3 E GFR WT 细胞凋亡相关蛋白表达水平的影响

经过15 h 处理后，LG 10 µmol/L+EGF 组与其他组相比，可以上调Bax 和下调Bcl-2 蛋白的表达，诱导Cytochrome-C 释放，激活Caspase-3、Caspase-6、Caspase-7，使得Cleaved-Caspase-3、Cleaved-Caspase-6、Cleaved-Caspase-7 的表达上调（图7）。这表明LG 通过激活Bcl-2 家族、释放 Cytochrome-C 来激活 Caspase 家族，通过Caspase-3、Caspase-6 和 Caspase-7 执行Ba/F3 EGFR WT 细胞凋亡，且在EGF 存在时细胞凋亡蛋白表达增加。

2.7 LG 对Ba/F3 E GFR WT 细胞周期相关蛋白表达水平的影响

经过15 h 处理后，LG 10 µmol/L+EGF 组与其他组相比，上调细胞内P27 蛋白表达（图8），阻抑细胞周期由G1/S 期向下一时期转移，从而抑制CDK6 蛋白的表达，进而抑制Cyclin D1 的表达，将Ba/F3 EGFR WT 细胞的周期阻滞在G1/S期，同时对 Cyclin A2 的表达也有抑制作用，Cyclin A2 蛋白的调控周期是S 期。表明LG 能够将Ba/F3 EGFR WT 细胞的周期阻滞在G1/S 期，且在EGF 存在时对细胞周期相关蛋白阻滞效果更加明显。

3 讨论与结论

3.1 讨论

本实验用的转染方法是电穿孔转染法[15]，使用NeonTM电转染系统。利用Ba/F3 细胞自身不表达EGFR、依赖于白介素3（IL3）且生长迅速易于转染等特点，以Ba/F3 为模式细胞使用电转染的方法将EGFR WT 质粒导入Ba/F3 细胞，构建了Ba/F3 EGFR WT 细胞。根据普洱茶学教育部重点实验室前期的实验基础，EGFR WT 转染条件为1 400 V，20 ms，2 pulse。已有文献报道，用Ba/F3 细胞进行转染构建稳定表达EGFR 的Ba/F3 细胞[16]。Xie 等[17]通过使用IL3 剥夺法成功构建表达 EGFR-insH 突变的 Ba/F3 细胞系（Ba/F3-insH 细胞系）。Yuza 等[18]通过抗生素筛选和IL3 独立筛选构建了表达3 个EGFR 20 号外显子突变的Ba/F3 细胞。为了获得单一来源且稳定表达EGFR 的细胞株，在培养基中添加筛选抗生素对Ba/F3 EGFR WT 细胞进行单克隆培养。证明Ba/F3 EGFR WT 细胞能够脱离IL3 独立生长，且通过流式细胞术和Western blot 实验证明是高表达EGFR 的野生型肺癌细胞。因此本实验采用的细胞系构建方法是成功的，可以为质粒转染和细胞系构建提供新的方法和思路。

已有研究表明，EGFR 信号的异常活化及其导致的下游信号激活与癌症的驱动因素（标志特征）密切相关[19]，使用靶向药物特异性地封闭EGFR 信号，将对癌症的治疗产生重要影响。目前关于EGFR 的靶向药物主要包括单抗类药物和小分子酪氨酸激酶抑制剂[20]。2004 年6 月，美国科学家Lynch 等[21]和Paez 等[22]发现，具有EGFR突变的肺癌患者使用靶向药物治疗可以有更好的治疗效果。研究结果显示，吉非替尼（Gefitinib）在治疗具有EGFR 突变的肿瘤患者有效率高达80%以上，而这种药物在治疗无突变的野生型（Wild-Type）肿瘤患者基本无效[23]，随后这一观点，在一年内相继被Mu 等[24]、Mitsudomi 等[25]、Han 等[26]和Huang 等[27]各国科学家证实。因此为野生型EGFR 肺癌患者寻找新的治疗方案和药物成为科学家研究的难题。

由于癌症机制复杂性，不同药物的敏感性和耐药性、缺乏标志物以及药物监管测试都给靶向药物的上市带来巨大挑战[28]。不乏患者在接受靶向药物治疗时产生许多副作用，如皮疹、腹泻和血压等问题[29]，因此人们将目光转向来源广泛、毒副作用小的天然化合物。天然化合物种类繁多，许多天然化合物的抗癌潜力已被开发[30]。90 年代中期，有2 种喜树碱类拓扑替康和伊立替康[31-32]获得FDA 批准用于治疗各种类型的癌症。2005年紫杉醇获批用于治疗转移性乳腺癌、胰腺癌和非小细胞肺癌[33]。目前大部分抗癌药物是天然产物来源[34]，已有文献报道，天然化合物LG 能够诱导人大细胞肺癌细胞死亡[13]，但并未明确靶点。对于非小细胞肺癌，LG 可以抑制EGFR 相关蛋白磷酸化，因此以EGFR 为作用靶点进行一系列验证。由于此实验未开展动物实验，LG 在体内表现还不明确，其与EGFR 具体结合位点还有待进一步确认。

3.2 结论

经实验结果证明，LG 在调控EGFR 野生型肺癌细胞增殖方面起到重要作用，其机制主要是通过抑制Ba/F3 EGFR WT 细胞EGFR 及下游相关蛋白磷酸化水平表达，进而靶向细胞凋亡、细胞周期，从而通过诱导细胞凋亡来抑制野生型EGFR肺癌细胞Ba/F3 EGFR WT 的存活。本研究有望为调控野生型EGFR 肺癌肿瘤提供药物开发的新思路。