高效液相色谱法测定小儿生血糖浆中尿囊素含量*

2022-09-08陈玉龙张亚锋董曼曼

中国药业 2022年17期

陈玉龙，荀英，孙晓，张亚锋，董曼曼，李敏

（1.陕西省药品和疫苗检查中心，陕西西安710065；2.陕西省渭南市中医医院，陕西渭南714000；3.陕西省西安市食品药品检验所，陕西西安710054）

贫血对儿童的健康成长有一定影响，中医药治疗小儿贫血效果较好［1-2］。小儿生血糖浆治疗小儿缺铁性贫血及营养不良性贫血起效更迅速，药品不良反应发生率低，且口感较好，更易被儿童接受［3-7］。小儿生血糖浆由山药、大枣、熟地黄、硫酸亚铁等制成，目前国内共有8个批准文号，现行药品标准［8］含量测定项下山药［以尿囊素（C4H6N4O3）计［9］］的含量测定操作烦琐、费时，专属性及重复性差。本研究中建立了测定小儿生血糖浆中尿囊素含量的高效液相色谱（HPLC）法。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

UltiMate3000型高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），配有Chromeleon7.2工作站，二极管阵列（DAD）检测器；Agilent1260型高效液相色谱仪（美国Agilent公司），配有DAD检测器；MS105型电子天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司，精度为十万分之一）；KQ-700 VDB型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司，功率为700 W，频率为100 kHz）。

1.2 试药

小儿生血糖浆（西安润泰药业有限公司，批号分别为2018901，2018902，20181203）；尿囊素对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111501-200202）；甲醇（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；超纯水（实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Waters XBridge Amide柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～21.0 min时94%A，21.0～21.5 min时94%A→80%A，21.5～28.0 min时80%A，28.0～28.5 min时80%A→94%A，28.5～35.0 min时94%A）；流速：1.0 mL/min；检测波长：191 nm；柱温：30℃；进样量：10 μL。理论板数按尿囊素峰计应不低于4 000。

2.2 溶液制备

取尿囊素对照品36.06 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得每1 mL含3.606 mg的对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液1 mL，置100 mL容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，即得每1 mL含36.06 μg的对照品溶液。精密量取样品5 mL，置25 mL容量瓶中，加甲醇适量，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）15 min，放至室温，用甲醇定容，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。按现行药品标准［8］制备不含山药的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.3 方法学考察［10-11］

专属性试验：精密吸取2.2项下对照品溶液、供试品溶液、阴性对照品溶液各适量，按2.1项下色谱条件进样测定，结果分离度大于1.5，尿囊素峰理论板数超过4 000，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：精密吸取2.2项下尿囊素对照品溶液（质量浓度为3.606 mg/mL）适量，加甲醇稀释成质量浓度分别为18.03，36.06，72.12，144.2，288.50 μg/mL的系列对照品溶液，以尿囊素质量浓度（X，μg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=0.327 7X+1.073 7，r=0.999 9（n=5）。结果表明，尿囊素质量浓度在18.03～288.50 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度试验：精密吸取尿囊素对照品溶液（质量浓度为36.06 μg/mL）适量，按2.1项下色谱条件进样测定6次。结果保留时间和峰面积积分值的RSD分别为0.13%和1.72%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品（批号为2018902）适量，依法制备供试品溶液，共6份，按2.1项下色谱条件进样测定。结果的RSD为1.20%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品（批号为2018902）适量，依法制备供试品溶液，分别于制备后0，3，8，13，18，24 h时按2.1项下色谱条件进样测定。结果峰面积的RSD为0.80%（n=6），表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

加样回收试验：精密量取样品（批号为2018902，质量浓度为0.290 4 mg/mL）5 mL，共9份，分别置25 mL容量瓶中，按50%，100%，150%比例分别加入尿囊素对照品溶液（质量浓度为0.288 5 μg/mL），各3份，依法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按外标法计算含量。结果见表1。

表1 加样回收试验结果（n=9）Tab.1 Results of the recovery test（n=9）

耐用性试验：在2.1项下色谱条件基础上，通过改变色谱柱（Waters XBridge Amide柱、Welch XB-NH2柱、Agela Innoval Durashell NH2柱）、流动相（低组分流动相比例变化±5%）、柱温［（30±5）℃］、流速［（1.0±0.2）mL/min］、检测波长［（191±2）nm］，考察方法耐用性。结果不同色谱条件下样品测定含量与拟订方法测定含量的RSD均不超过3.60%，表明方法耐用性良好。

2.4 样品含量测定

取3批（批号分别为2018901，2018902，2018203）样品，按2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按外标法计算含量。结果每1 mL样品中尿囊素含量分别为0.22，0.29，0.30 mg，平均为0.27 mg。

A.对照品溶液B.供试品溶液C.阴性对照品溶液图1高效液相色谱图1.AllantoinA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

3 讨论

3.1 前处理方法改进

原标准［8］含量测定项下尿囊素测定方法先用乙醇提取、离心、上清液浓缩、冷藏、浓缩，再重复提取1次，用水定容。操作烦琐、费时，且提取效果和方法重复性均较差。现修订方法采用甲醇超声提取，极大地简化了提取步骤，操作简单、省时，方法重复性好。

3.2 色谱方法改进

原标准［8］高效液相色谱分析采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的反向色谱柱，该类型色谱柱对尿囊素类极性较大物质的保留能力很弱，导致尿囊素出峰时间过早，无法与制剂中的干扰物质完全分离，专属性较差，无法满足分析要求；检测波长为201 nm，并非尿囊素色谱峰的最大吸收波长，灵敏度有待提高。现修订方法采用以丙基酰胺键合硅胶为填充剂的正向色谱柱，对极性物质选择性更强，保留能力和专属性均增强，采用乙腈-水（94∶6，V/V）为初始流动相进行目标组分的分离，后用乙腈-水（80∶20，V/V）洗脱保留更强的杂质峰，有效节省了分析时间；更换检测波长为191 nm，更接近尿囊素的最大吸收波长，提高了检测灵敏度，达到了分析要求。