高效液相色谱法同时测定饲料中5种合成类抗氧化剂含量

2022-09-08张浩然华贤辉

中国饲料 2022年17期

商军，张浩然，田恺，华贤辉，徐汀

（上海市兽药饲料检测所，上海 201103）

饲料在运输、贮存过程中，不饱和油脂和其他对氧不稳定的物质（如维生素类）很容易受到破坏，而且这种破坏是一种不可逆的损害。饲料氧化损害会破坏脂溶性维生素和色素，明显降低饲料蛋白和能量利用效率，增加饲料的毒性产物，也使动物生产性能降低，甚至中毒死亡（李方方等，2020）。在饲料中添加少量或微量的抗氧化剂，可延长饲料的保质期，提高饲料的利用率，有效地避免上述不利因素，为此，抗氧化剂是饲料工业生产中不可缺少的一种添加剂（王杰等，2019；黄涛等，2004）。抗氧化剂可分为合成类和天然类，目前在饲料工业生产中使用的绝大多数为合成类抗氧化剂，作为合成类抗氧化剂允许在饲料中添加使用的有没食子酸丙酯（PG）、特丁基对苯二酚（TBHQ）、乙氧基喹啉（EQ）、丁基羟基茴香醚（BHA）和二丁基羟基甲苯（BHT），上述5种合成类抗氧化剂收载于《饲料添加剂品种目录》（农业部第2045号公告）中。

由于合成类抗氧化剂过量使用会对人畜产生毒性，为此，在《饲料添加剂安全使用规范》（农业部第2625号公告）中对上述5种合成类抗氧化剂在饲料中使用都有着明确的限量要求。其中，单独使用时，在配合饲料或全混合日粮中的最高限量分别为PG 100 mg/kg，EQ 150 mg/kg（犬除外，犬为100 mg/kg），BHA、BHT和TBHQ为150 mg/kg；同时使用时，在配合饲料或全混合日粮中的总量不得超过150 mg/kg；单独或同时在饲用油脂中使用时，总量不得超过200 mg/kg。目前，作为饲料中合成类抗氧化剂的测定标准（GB/T 17814-2011）中规定了4种合成类抗氧化剂检测，未将特丁基对苯二酚（TBHQ）列入检测项目。为此，参考目前国内外相关文献报道（胡玉霞，2019；李满秀等，2015；李兴根等，2012；蔡发等，2010；Perrin C，2003；Christian等，2002），提出了对该标准的修订（国家标准项目计划编号：20193212-T-469），本实验采用高效液相色谱法同时测定饲料中5种合成类抗氧化剂含量，以增强修订后标准的适用性和普适性，为《饲料添加剂安全使用规范》中规定上述5种合成类抗氧化剂在饲料中规范合理使用提供检测技术支撑。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂高效液相色谱仪（Waters 2695-2998，配有紫外检测器或二极管阵列检测器，美国Waters公司）；色谱工作处理站（EmpowerⅡChem-station，美国Waters公司）；超声波清洗器（KQ-250DB型，昆山市超声波仪器有限公司）；乙腈（色谱纯，默克公司）；乙酸（色谱纯，默克公司）；PG标准品（CAS：121-79-9，含量≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；TBHQ标准品（CAS：1948-33-0，含量≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；EQ标准品（CAS：91-53-2，含量≥95%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；BHA标准品（CAS：25013-16-5，含量≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；BHT标准品（CAS：128-37-0，含量≥98%，德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；一次性注射器（1、10 mL，山东朱氏药业集团有限公司）；有机相针式滤器（直径25 mm，孔径0.45 μm，美国PALL公司）；有机相微孔滤膜（孔径0.22 μm，美国PALL公司）；水（符合GB/T 6682一级用水的规定）；样品（市场抽检及部分企业提供）。

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液的制备（1）混合标准储备溶液：分别准确称取适量5种抗氧化剂标准品，用乙腈制备成含PG的质量浓度为0.5 mg/mL，含TBHQ、EQ、BHA和BHT的质量浓度为1 mg/mL的混合标准储备溶液，置于棕色容量瓶中，2～8℃冰箱中保存备用，有效期为2周。（2）混合标准系列工作溶液：准确移取上述混合标准储备溶液20 mL于200 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀；分别准确移取适量上述溶液，然后用乙腈分别稀释制备成使PG的质量浓度为0.50、2.00、4.00、8.00、16.0、20.0 μg/mL和25.0 μg/mL，TBHQ、EQ、BHA、BHT的质量浓度为1.00、4.00、8.00、16.0、32.0、40.0 μg/mL和50.0 μg/mL的混合标准系列工作溶液。临用现配。

1.2.2 试样溶液制备（1）固体类试样：准确称取已粉碎、全部通过0.42 mm孔径分析筛、已混匀的试样5 g，置150～250 mL的具塞三角瓶中，准确加入50 mL的乙腈，摇匀，置超声波清洗器中提取30～40 min，在提取过程中振摇2～3次。放冷至室温，摇匀。用10 mL注射器吸取上述提取液适量，用有机相针式滤器（直径25 mm，孔径0.45 μm）过滤，滤液再经0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。供液相色谱测定。（2）动物油脂类试样：准确称取5 g油脂，置150～250 mL的具塞三角瓶中（如为凝固状，置65℃水浴中加热7 min，使融化），准确加入50 mL的乙腈，置超声波清洗器中，在55℃的水浴中超声提取约40 min。冷却至室温，取上层液10～20 mL，置离心管中，9000 r/min离心5 min，用10 mL注射器吸取上述离心液适量，用有机相针式滤器（直径25 mm，孔径0.45 μm）过滤，滤液再经0.22 μm微孔滤膜过滤后备用。供液相色谱测定。

1.2.3 液相色谱条件色谱柱：十八烷基键合相（C18）柱（长150 mm× 内径4.6 mm，粒径5 μm）；进样体积：20 μL；波长：200～400 nm；检测波长：280 nm；洗脱方式：等度洗脱；流动相：乙腈-2%乙酸溶液（65+35，V1+V2）；流速：0.5 mL/min；柱温：20～30℃。

1.2.3 试样测定分别取混合标准系列工作溶液和试样溶液分别按“1.2.3”的液相色谱条件上机测定，以保留时间定性，试样溶液中抗氧化剂的保留时间与混合标准系列工作溶液中抗氧化剂（质量浓度相当）的保留时间应一致，其相对偏差在±2.5%之内。以5种抗氧化剂的质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。试样溶液中抗氧化剂的质量浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出标准曲线的线性范围，应将试样溶液用乙腈稀释后，重新测定。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的确定

2.1.1 检测波长的选择取混合标准系列工作溶液进行检测波长的选择，采用二极管阵列检测器在波长200～400 nm内进行紫外扫描，提取相应紫外光谱图，结果见图1。结果表明，5种抗氧化剂在波长在200～400 nm均有2处最大紫外吸收波长，其中在220 nm波长附近处均有最大吸收，其他最大吸收波长处又各不相同。由于饲料试样基质较为复杂，选择已接近紫外末端吸收的220 nm波长附近处作为检测波长，会对5种抗氧化剂的测定产生较大的干扰。为使测定过程中5种抗氧化剂均能得到较好的响应值（峰面积），分别在230、250、280 nm和310 nm波长处分别提取相应色谱图，结果见图2。结果表明，在230 nm波长处提取的色谱图，溶剂峰的响应值较待测5种抗氧化剂峰的响应值大；在250 nm波长处，TBHQ峰和BHT峰的响应值太小；在310 nm波长处，BHT峰没有响应；在280 nm波长处，5种抗氧化剂的峰面积均最为适宜。本文选择280 nm作为5种抗氧化剂的检测波长。

图1 5种抗氧化剂在波长200～400 nm内紫外扫描图

图2 5种抗氧化剂在不同波长处的提取色谱图

2.1.2 流动相的选择与优化本文采用等度洗脱方式，分别考察了不同流动相组成（甲醇-甲酸、乙醇-乙酸和乙腈-乙酸）对饲料中5种抗氧化剂测定的影响，经实验表明，采用乙腈-乙酸组成的流动相，5种抗氧化剂在不同品牌的C18柱上均能得到满意的色谱性能。为确保本方法的适用性，以5种抗氧化剂均应符合色谱峰的保留时间（t）3≤t≤30和色谱峰间的分离度（R）≥1.5作为优化指标。取混合标准系列工作溶液和添加5种抗氧化剂的试样溶液分别对乙腈-乙酸流动相组成的配比进行了优化选择。实验结果表明，当流动相中乙腈的比例为65%时，5种抗氧化剂的色谱峰均能完全分离（R≥1.5），最先洗脱出的PG色谱峰的保留时间约为3.9 min，最后洗脱出的BHT色谱峰的保留时间约为25.5 min，保留时间也均在3≤t≤30范围内。当选择乙酸溶液浓度为2%（V/V）时，5种抗氧化剂色谱峰保留时间的重复性和色谱峰形均良好。本文选择了乙腈-2%乙酸溶液（65+35，V1+V2）组成的流动相。优化结果见图3。

图3 流动相和流速优化后5种抗氧化剂的典型色谱图

2.1.3 流速的优化以优化后的流动相，分别设定流速为0.5、0.6、0.8 mL/min和1.0mL/min来考察对5种抗氧化剂的t和R的影响，为确保本方法的适用性，以5种抗氧化剂均应符合色谱峰的保留时间（t）3≤t≤30和色谱峰间的分离度（R）≥1.5作为优化指标。取混合标准系列工作溶液和添加5种抗氧化剂的试样溶液分别对流速进行了优化选择。实验结果表明，当流速为0.5 mL/min时，5种抗氧化剂的色谱峰均能完全分离（R≥1.5），保留时间均为3≤t≤30。本文选择流速为0.5 mL/min。优化结果见图3。

2.2 预处理方法的选择

2.2.1 固体类试样根据相关文献的报道（黄彪等，2018；杨春林等，2013；钟伟燕等，2012；Saad等，2007），测定样品中抗氧化剂含量的提取方法主要有层析柱法、液液萃取法、固相萃取法、超声波辅助有机溶剂直接提取法等。层析柱法因层析柱填充的效率差异而影响测定结果的重复性，操作耗时较长，不适合大批量样品的处理；液液萃取法虽处理方法简单，但回收率相对较低，不适合大批量样品的处理；固相萃取法具有有机溶剂消耗少、分离效果好、操作简单、便于自动化的优点，缺点是顺序操作，针对不同基质的样品会导致不同步骤的优化复杂，甚至不能优化；超声波辅助有机溶剂直接提取法不需专用设备，提取效率较高，适合大批量样品的处理。根据饲料样品的性质，选择了乙腈为提取有机溶剂，选用了超声波辅助有机溶剂直接提取法，按“1.2.2”试样溶液制备分别对加标的不同基质饲料试样进行了提取处理，试验结果见“2.3.3”的加标回收率实验。结果表明，采用乙腈为提取有机溶剂，超声水浴助溶40 min，提取液经有机相针式滤器（直径：25 mm，孔径：0.45 μm）过滤，实现提取，上述提取方法适用于固体类饲料试样中5种抗氧剂的测定。

2.2.2 动物油脂类试样部分动物油脂，如牛油，常温下为凝固状态，因此在用乙腈提取之前，需要将其融化。5 g油脂在融化状态下，加入50 mL乙腈后，常温超声提取，会出现重新凝固的现象。因此，需要在一定温度下进行超声提取。根据40～65℃下超声提取的现象，发现超声温度设置为55℃时，能够避免油重新凝固，乙腈和融化状态的油脂能够充分接触。此外，为考察55℃超声40 min对各组分的影响，将50 mL的混合标准作同步处理，和未超声处理的等浓度混合标准液峰面积相比，处理后的各组分峰面积的回收率为98.7%～101.4%。因此，选择超声提取温度为55℃，以保证油脂样品中抗氧化剂的充分提取。55℃超声提取后，试样溶液温热，如直接取上层过滤膜，会出现浑浊现象，因此需要静置10 min以上。为提高效率，取上层液10～20 mL，置离心管中，9000 r/min离心5 min，用有机相针式滤器（直径25 mm，孔径0.45 μm）过滤，实现提取。实验结果见“2.3.3”的加标回收率实验。结果表明，上述提取方法适用于动物油脂类试样中5种抗氧剂的测定。

2.3 方法的确认

2.3.1 线性关系按“1.2.3”的液相色谱条件，取混合标准系列工作溶液进行液相色谱分析，每个浓度进样3次。以5种抗氧化剂色谱峰的峰面积为纵坐标，标准系列工作溶液的质量浓度为横坐标绘制标准曲线。结果表明，PG在质量浓度0.50～25.00 μg/mL，BHA、EQ、TBHQ和BHT在质量浓度1.00～50.00 μg/mL均与峰面积呈良好的线性关系（相关系数r2＞0.999）。结果见图4。

图4 混合标准（PG、TBHQ、BHA、EQ和BHT）系列工作溶液的线性关系图

2.3.2 检出限（LOD）和定量限（LOQ）选取空白基质饲料，添加一定浓度的5种抗氧化剂标准溶液，按“1.2.2”的试样溶液制备，“1.2.3”的液相色谱条件进行测定。依据设定5种抗氧化剂的LOD为信噪比（S/N）=3，LOQ为信噪比（S/N）=10。经实验，确定了本方法的检出限分别为：PG 1.8 mg/kg、BHA 1.9 mg/kg、EQ 2.0 mg/kg、TBHQ 1.9 mg/kg、BHT 5.0 mg/kg；本方法的定量限分别为：PG 8.8 mg/kg、BHA 8.7 mg/kg、EQ 8.9 mg/kg、TBHQ 8.6 mg/kg、BHT 10.0 mg/kg。结果见图5。

图5 LOD和LOQ确定的典型色谱图

2.3.3 加标回收率与精密度分别准确称取配合饲料、维生素添加剂预混合饲料、鱼粉、牛油约5 g，根据5种抗氧化剂的线性范围，依低、中、高分别加入3个浓度水平的5种抗氧化剂混合标准溶液各5份，按“1.2.2”制备成试样溶液，进行5种抗氧化剂的质量浓度测定。考虑到样品中存在一定本底，不是理想的空白基质，因此，针对不同本底进行了相应组分的低、中、高浓度添加，调整稀释倍数，使加标试样溶液中抗氧化剂的质量浓度在标准曲线的线性范围内，扣除本底后分别计算添加试样中的平均回收率和相对标准偏差（RSD）。结果见表1和图6。结果表明，在不同基质饲料的加标试样中PG的平均回收率为76.2%～98.8%（RSD 1.1%～9.6%）；TBHQ的平均回收率为77.2%～97.8%（RSD 0.9%～4.3%）；EQ的平均回收率为77.3%～98.0%（RSD 0.7%～6.9%）；BHA的平均回收率为76.7%～95.8%（RSD 1.1%～6.2%）；BHT的平均回收率为75.3%～95.8%（RSD 0.9%～7.1%）。由上述实验结果可知，方法准确可靠。

图6 配合饲料、维生素添加剂预混合饲料、鱼粉和牛油分别添加低、中、高3个浓度水平的混合标准后的典型色谱图

表1 不同基质饲料的加标回收率与精密度测定结果（n=5）

2.4 试样测定分别取骨粉、鱼粉、鸡肉粉、鸡油、牛油、仔猪前期浓缩饲料、育肥猪配合饲料、4%母猪哺乳期复合预混合饲料、0.3%肉种鸡复合预混合饲料和宠物维生素预混合饲料各3份，按“1.2”的实验方法进行测定，结果见表2。结果表明，上述饲料样品中抗氧化剂检出的有TBHQ、EQ、BHA和BHT，其中仔猪前期浓缩饲料和牛油中检出TBHQ，骨粉、鱼粉和鸡肉粉中检出EQ，鸡油、4%母猪哺乳期复合预混合饲料和宠物维生素预混合饲料中检出BHA，牛油、育肥猪配合饲料、0.3%肉种鸡复合预混合饲料和宠物维生素预混合饲料中检出BHT。在鱼粉和宠物维生素预混合饲料中添加复合抗氧化剂，从测定结果可知目前饲料工业中主要使用的合成类抗氧化剂为EQ、BHA和BHT。