溶血标本在应用化学发光免疫分析法检测HIV抗体时对检测结果的影响

马伟刚

(濮阳县人民医院 医学检验科，河南 濮阳 457100)

艾滋病作为临床较常见的传染性疾病，患病率呈现逐年升高趋势，主要通过性交、血液、静脉吸毒等途径传播，可直接破坏机体的免疫能力，并造成反复感染，无法治愈，给患者身心健康造成极大危害。目前，临床尚无治疗艾滋病的确切疗法，所以加强艾滋病筛查、切断感染源至关重要。既往，临床多通过测定血清内人类免疫缺陷病毒(HIV)的方式诊断艾滋病，但其中检查方式较多，例如化学发光免疫分析、酶联免疫吸附法等，不同检查方式的结果可能存在较大差别，引起临床重视，尽早选择合适的诊断方式成为关键。其中酶联免疫吸附法被广泛运用于临床，但有研究指出化学发光免疫分析法(CIA)的灵敏度及特异度较高，且自动化程度较好，可成为代替酶联免疫吸附法的主要检测方式。选择濮阳县人民医院2019年12月至2021年12月纳入的86例健康体检者，深究溶血标本通过CIA检测HIV抗体检测结果的影响，结果如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择本院2019年12月至2021年12月纳入的86例健康体检者，其中男性48例，女性38例；年龄25～73岁，平均年龄(43.58±2.69)岁；体质指数19～25 kg/m，平均体质指数(22.41±1.03)kg/m。所有健康体检者均在相同的条件下收集外周静脉血标本，将其划分成四份，即正常标本(A组)、经人工溶血使游离血红蛋白不足60 mmol/L(B组)、60～110 mmol/L(C组)、超 出110 mmol/L(D组)，各组标本的基础信息相比，差异无统计学意义(＞0.05)。本研究经本院伦理委员会审核批准。

纳入标准：(1)健康体检者与亲属均知情，并签署同意书；(2)无HIV感染；(3)意识清楚，自愿参与本次试验。

排除标准：(1)临床资料不全者；(2)合并精神疾病、免疫系统疾病、重要脏器功能异常、先天性疾病、意识障碍、其他传染疾病者；(3)中途退出试验者。

1.2 方法

酶联免疫吸附法的仪器是酶标仪(郑州安图，PHOMO)、洗板机(郑州安图，iwo-960)以及配套的HIV抗体试剂盒；而CIA选择发光仪(郑州安图，A2000 plus)及配套的HIV抗体试剂盒。

收集健康体检者肘正中静脉血(10 mL)，放在离心管内，分成四份，其中一份为正常标本(A组)，等待血液凝固，以3 000 r/min速度开展离心操作，10 min后取上层清液。另三份通过物理振荡、反复冻融的物理方式实施人工溶血操作，分离血清，通过邻联甲苯胺法检测游离血红蛋白，明确标本的溶血程度，分别是游离血红蛋白不足60 mmol/L(B组)、60～110 mmol/L(C组)、超出110 mmol/L(D组)。最后严格遵照酶联免疫吸附法、CIA及说明书要求检测HIV抗体。

1.3 观察指标

(1)比较各组之间的吸光度A值、化学发光值(RLU)，其数值大于等于临界值即为阳性。(2)对比各组不同检查方式的阳性率。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 各组的检测结果比较

各组之间的吸光度A值比较差别明显，差异有统计学意义(＜0.05)，但RLU值无显著差别，差异无统计学意义(＞0.05)。见表1。

表1 各组的检测结果比较(± s )

2.2 各组的阳性率比较

各组的酶联免疫吸附法的阳性率存在显著差异，差异有统计学意义(＜0.05)，但CIA阳性率无明显差别，差异无统计学意义(＞0.05)。见表2。

表2 各组的阳性率比较[n(%)]

3 讨 论

据有关数据显示，艾滋病作为全球范围流行的传染病，每年因艾滋病死亡的人数约2 500万。最早于1981年，美国发现了第一例艾滋病患者，随后艾滋病在各地区传播扩散，尤其是在人口流动性较强、毒品交易泛滥、性解放环境之下，HIV从高风险人群逐渐向普通人群扩散，并呈现快速增长趋势。加上艾滋病的潜伏时间较长，短时间之内患者并不会出现明显症状，从而容易被人忽视，随后再经血液透析、静脉吸毒、性接触等途径传播。而国内关于艾滋病的流行病学调查结果显示，其发生率呈现逐年升高趋势，并表现为西高东低、南高北低趋势，特别是西南地区、新疆成为该病的高发地区。针对此，临床尚无特效治疗方式，早期采取HIV抗体检查、尽快确诊艾滋病在切断传播途径、控制传播上具有重要意义。

目前，临床针对HIV的检查方式较多，其中以HIV抗体检测较常见，但不同检测方式可能导致不同结果，甚至造成假阳性。经分析发现，酶联免疫吸附法较多见，检查过程中病毒抗体能够和固相载体上的抗原以及抗体发生结合反应，随后引起典型的氧化还原反应，经肉眼、显微镜即可清楚地观察，同时利用酶标仪，针对检查结果作出准确的判断，由此可见，该检查方法的特异性较高。但其操作较为复杂，通常需要2 h左右才可得到结果，耗时较长，且检测期间需要重复洗板、加氧操作，极易使结果出现偏差，并引起假阳性情况，特别是在艾滋病毒逆转录情况下，可能出现误诊。针对HIV浓度较低的标本，使用该方式检测的灵敏度较低，这直接增加假阴性的发生率。

在检查期间，还需要采取一些辅助设备，其设备的操作使用对检查人员的能力存在较高的要求，一旦出现操作上的失误，可直接降低患者检查结果的准确度。此外在检查中，检查试剂可受到较多因素的影响，进而导致检查工作出现较多不确定性，并延长检测消耗的时间，导致检查结果需要较长时间才可显现，从而影响检查的效率，甚至耽误患者最佳治疗时机。有研究指出，酶联免疫吸附检测溶血标本的结果偏差较大，可能是由于游离血红蛋白的过氧化物酶活性较高，并与辣根过氧化物酶的疗效相当，经酶联免疫吸附法检查后催化了底物显色，从而引起假阳性。最早于20世纪90年代，临床将CIA运用在HIV抗体的检查上，这主要融合了化学发光体系与免疫反应，属于新型标记免疫检测技术。临床经分析，发现CIA的作用机制与酶免疫、放射免疫较为相近，不同的是该检测方式主要利用发光底物的发光强度进行结果判定，以此得到的光量子数与待测样本上的抗原/抗体浓度存在密切关系，最终导致该方式被广泛运用在定量、定性以及半定量检测中，并受到广泛认可。随着临床不断深入研究，发现与酶联免疫吸附法进行对比，CIA并不会受到游离血红蛋白上类过氧化物酶活性的干扰，对此可避免因颜色反应而影响检查结果。通常情况下，CIA选择抗体以及抗原上标记酶、发光物质标记展开检查工作，在结束检查后，于试剂内添加氧化剂来介导其标志物发光，随后绘制标准曲线开展发光强度的测定，最后检测发光物的含量。在临床检查中的灵敏度较高，且无污染，加上标记物的保存时间较长，线性范围相对较宽，存在一定自动化，可显著提升检查效率。同时该技术中包含电化学反应与化学发光过程，具体检测期间标记抗原与抗体发生特异性结合，开启电发光过程，此过程能够循环，进而提升灵敏度。且整个检查过程仅需20 min即可完成，有效缩短了检查时间，较酶联免疫吸附法更早检出HIV，从而减少诊断窗口期。除此之外，CIA作为异相免疫分析方式，抗原抗体结合效果较好，灵敏度较高，且线性范围较宽，发光强度可分成4～6个量级，与检测样本的物质浓度呈现线性关系。加上该方式的操作简便，检查期间仅需要一种试剂即可完成检查，也无需光源照射，有效规避了光散射、光源稳定性的干扰，且自动化程度较高，耗时较短，可被广泛运用在急诊快速检查中。有研究指出，溶血标本对多种检查方式的结果存在较大影响，极易引起假阳性，从而耽误后续治疗。

本研究结果表示：各组之间的吸光度A值比较差异明显，差异有统计学意义(＜0.05)，但化学发光值(RLU)值无显著差别，差异无统计学意义(＞0.05)；各组的酶联免疫吸附法的阳性率，差异有统计学意义(＜0.05)，但CIA阳性率无明显差别，差异无统计学意义(＞0.05)，上述结果提示酶联免疫吸附法测定溶血标本的结果偏差较大，但对CIA，从而证实CIA可成为HIV抗体检查的重要方式。经分析发现，酶联免疫吸附法中，随着标本上溶血程度的不断增加，吸光度A值随之升高，且假阳性较高，可能是因为检测期间，溶血标本上游离血红蛋白增多，接受温育操作后，游离的血红蛋白极易被吸附至反应孔内，加上血红蛋白通常包含亚铁血红素，其具备过氧化物酶相同的作用，通过氧化剂影响之下显色，从而导致游离血红蛋白中加入了化学发光底物液，并产生一定反应，呈现异常结果，引起假阳性，使得检查结果出现偏差。另外血红素上红色对比色结果的干扰较大，既往多选择标本空白清除去比色结果的影响，但该检查期间加入了光吸收，从而干扰波长相似的比色实验，最终影响检查结果的准确性。而CIA的特异度较高，并不会受到各方面因素的影响，从而保证检验结果的准确性，同时鉴于该操作通常于封闭的流动系统内完成，故而其可有效规避交叉感染的发生，同时可保证试剂的稳定性，最终提升检查结果的准确性。由此发现，溶血标本对各项检查均可产生一定影响，但对CIA的影响较小，其可成为HIV抗体检查的主要方式，值得应用。

值得注意的是，临床数据显示血液标本产生溶血的几率较高，通常与标本采集操作不当、标本送检延迟等因素存在密切关系，需引起重点关注。一旦发现溶血标本，检验科应立即与送检科室取得联系，结合科室具体情况以及检查项目对其溶血原因进行分析，对于溶血影响较大的情况，可通知相关科室重新收集标本，以此保证检查结果的准确性。除此之外，医院还应加强收集标本人员的操作能力，定期开展相关知识培训，使其完全掌握血液标本的正确的收集方法，最大限度地避免溶血标本出现。但本次试验中仍存在较多缺陷，比如试验前虽然拟定了严格的入组与剔除标准，但最后纳入的观察对象是否合理还需要商榷；除此之外此次试验中的观察对象样本数量较少，针对此，临床还可选择更多观察对象，从而保证其样本的多样性，进一步提升试验结果的准确性及精确性。

综上所述，酶联免疫吸附法测定溶血标本的结果偏差较大，但对CIA的影响较小，可成为HIV抗体检查的主要方式，但应注意随着溶血程度的增加，其也可能出现假阳性，对此，要求临床加强检测前的质量控制，保证标本合格，规避假阳性出现。