基于统计学分析的寒喘祖帕颗粒HPLC指纹图谱研究△

李柯翱，米尔扎提·麦麦提，张明惠，刘婷，苏海娣，马璇*

1.新疆奇沐医药研究院（有限公司），新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011；3.新疆维吾尔自治区药品审评查验中心，新疆 乌鲁木齐 830011

1 材料

1.1 仪器

LC-20AT 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-300DB 型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；BT25S型十万分之一电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；AE-100 型万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）。

1.2 试药

对照品没食子酸、芦丁、甘草苷、甘草酸铵（中国食品药品检定研究院，批号分别为110831-200302、100080-200306、111610-201607、110731-201619，纯度分别为91.5%、91.7%、93.1%和96.2%）；乙腈为色谱纯；娃哈哈纯净水；其他试剂均为分析纯。

寒喘祖帕颗粒（新奇康药业股份有限公司，编号为S1～S12，批号分别为170860、170851、170931、170849、170862、170853、170863、170932、170861、170864、170956、170957）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 分别精密称取没食子酸、甘草酸铵、甘草苷、芦丁对照品适量，用甲醇溶解，稀释成没食子酸、甘草苷、甘草酸铵、芦丁质量浓度分别为0.04、0.04、0.07、0.03 mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称量寒喘祖帕颗粒3.0 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞后称定锥形瓶质量，超声30 min 后取出置于试验台，静置至室温后称质量，用50%甲醇补足减失的质量，滤过，得续滤液，即得。

2.2 指纹图谱建立

2.2.1 色谱条件

Kromasil-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱（0～30 min，15%～30%A；30～45 min，30%～40%A；45～60 min，40%～60%A；60～70 min，60%～64%A）；柱温：35 ℃；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：220 nm；进样量：10 μL。

公司各级管理人员变动频繁，给“校企一体”教学模式的实施带来一定困难，新到岗的经理、主管在一段时间后才能熟悉这种培养方式，所以实施过程中会出现一定时期的断层。这种培养模式使校、企、学三方受益，公司人事变动对实施过程影响是暂时的，经过校企双方努力，使“校企一体”教学模式得以顺利实施。

2.2.2 方法学考察 精密度试验：称取寒喘祖帕颗粒1 份按2.1.2 项下方法制成供试品溶液。按2.2.1项下色谱条件，连续进样6 次，根据6 次测定结果，得到对应的色谱图。在对应色谱图中标示出所有共有峰，以甘草酸铵作为参照峰，计算图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积。结果显示，RSD 均小于2%，表明仪器精密度较好。

重复性试验：称取同一批次的寒喘祖帕颗粒6份，按2.1.2项下方法制成供试品溶液。按2.2.1项下色谱条件，6 份供试品溶液分别进样，得到对应的色谱图。在对应色谱图中标出所有共有峰，以甘草酸铵为参照峰，以甘草酸铵的出峰时间及峰面积为1，计算图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD均小于3%，表明该方法重复性较好。

稳定性试验：精密称取寒喘祖帕颗粒1 份，按2.1.2 项下方法制成进样供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，得到对应的色谱图。在对应色谱图中标示出所有共有峰，以甘草酸铵为参照峰，以甘草酸铵的出峰时间及峰面积为1，计算图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD 均小于3%，表明该方法在24 h内稳定。

2.2.3 共有峰的建立及鉴别 按2.1.2 项下方法精密称取12 批寒喘祖帕颗粒样品，制成供试品溶液，按2.2.1 项下色谱条件对各批供试品溶液进行测定，将所得的HPLC 色谱图进行叠加、分析、对比。进一步确定寒喘祖帕颗粒指纹图谱的共有模式图，进行共有峰的标记。按2.1 项下方法制备对照品溶液，进样得到对应的对照品溶液色谱图，将其与供试品溶液色谱图进行比对，根据保留时间确定共有峰，从光谱图中再分析确定各色谱峰的最大吸收波长。本研究采用对照品对比法共计标示出4 个色谱峰，分别为没食子酸，芦丁、甘草苷、甘草酸铵。该指纹图谱中有15 个峰（图1）；混合对照品图谱中1、5、7、13 号峰分别为没食子酸、芦丁、甘草苷、甘草酸铵（图2）；12 批寒喘祖帕颗粒样品HPLC 叠加图见图3。

图1 寒喘祖帕颗粒HPLC指纹图谱共有模式图

图2 没食子酸、芦丁、甘草苷、甘草酸铵混合对照品溶液的HPLC图

图3 12批寒喘祖帕颗粒的HPLC图

2.2.4 相似度结果分析 将上述经HPLC 分析测定的12 批寒喘祖帕颗粒样品得到的不同色谱图导入到“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2012 版）软件进行分析。在分析时，把其中1 批寒喘祖帕颗粒（批号：170853）的图谱数据作为参照图谱，按系统操作，采用平均数法生成对照指纹图谱R，再进行12批寒喘祖帕颗粒色谱图的相关分析，获得12批寒喘祖帕颗粒样品HPLC 指纹图谱相似度结果，相似度为0.907～0.997（表1）。由表1可知，寒喘祖帕颗粒各批次间质量相对稳定，产品安全性较好。

表1 12批寒喘祖帕颗粒的相似度结果

2.2.5 样品含量测定

2.2.5.1 线性关系考察 按2.1 项下方法制成没食子酸、甘草苷、芦丁、甘草酸铵质量浓度分别为0.16、0.16、0.16、0.40 mg·mL-1的混合对照品溶液，使用倍比稀释法，加甲醇分别稀释2、4、8、16、32倍，得6份质量浓度不同的混合对照品溶液，按2.2.1 项下色谱条件进样测定，记录待测成分的色谱峰面积。以峰面积为纵坐标（Y），以进样质量浓度为横坐标（X）进行线性回归，计算线性回归方程。结果显示，没食子酸、芦丁、甘草苷和甘草酸铵在相应范围内线性关系良好，见表2。

表2 没食子酸、甘草苷、芦丁、甘草酸铵的线性关系

2.2.5.2 方法学考察 精密度试验：称取寒喘祖帕颗粒样品1 份，按2.1.2 项下方法制成供试品溶液。按2.2.1 项下色谱条件，连续进样6 次，没食子酸、芦丁、甘草苷、甘草酸铵峰面积的RSD 分别为1.6%、1.8%、1.7%和1.6%。

重复性试验：称取同一批的寒喘祖帕颗粒样品6份，按2.1.2项下方法制成供试品溶液。按2.2.1项下色谱条件分别进样，没食子酸、芦丁、甘草苷、甘草酸铵含量的RSD分别为1.8%、2.4%、2.5%和1.4%。

稳定性试验：精密称取寒喘祖帕颗粒样品1 份，按2.1.2项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件分别在0、2、4、6、8、12、24 h进样，没食子酸、芦丁、甘草苷、甘草酸铵峰面积的RSD 分别为1.9%、2.2%、2.1%和1.5%。

加样回收率试验：精密称取已知含量的同一批寒喘祖帕颗粒6份，按2.1项下方法制成供试品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样，没食子酸、芦丁、甘草苷、甘草酸铵平均加样回收率分别为96.26%、96.13%、95.87%和97.65%，RSD分别为1.9%、2.1%、2.3%和1.8%。

2.2.5.3 含测测定 取12批寒喘祖帕颗粒，按2.2.1项下条件下测定，计算4个成分的含量，结果见表3。

表3 寒喘祖帕颗粒中4个成分质量分数mg·g-1

2.3 化学模式识别分析

2.3.1 聚类分析 采用SPSS 23.0统计软件对12批寒喘祖帕颗粒色谱数据进行处理，以欧式距离评分作为测量度，进行12批寒喘祖帕颗粒样品系统聚类分析（图4）。结果显示，12 批寒喘祖帕颗粒大致分为3类，Ⅰ类包括S1～S2、S5～S12，Ⅱ类包括S4，Ⅲ类包括S3。聚类分析中聚为一类的表示相似性较好。

图4 12批寒喘祖帕颗粒的聚类分析结果

2.3.2 主成分分析（PCA）采用SPSS 23.0 先对图谱中各个共有峰的峰面积标准化处理，然后对12批寒喘祖帕颗粒样品的15 个共有峰进行PCA，得出相关PCA 特征性及方差贡献率。前2 个主成分累积方差贡献率为80.675%，且特征根均大于1，提示这2个主成分能够代表共有峰的大部分信息。从图5可以看出，前2 个因子处在较为陡峭的斜率位置上，第3个因子斜率开始变得较为平缓，因此，选择2个主成分因子进行分析。主成分载荷矩阵见表4，其反映了各变量对主成分的贡献程度，主成分1 主要反映了4、6、7、8、10、11、13、14 号峰有较高的载荷值，7 号峰为甘草苷，13 号峰为甘草酸铵；主成分2 主要反映了3、5、9、12 号峰的信息，5 号峰为芦丁。通过成分得分系数矩阵计算综合得分，可以评价不同批号的整体质量，得分及排名见表5。

表4 寒喘祖帕颗粒样品色谱峰主成分载荷矩阵

表5 12批寒喘祖帕颗粒主成分得分、综合得分及排名

图5 寒喘祖帕颗粒指纹图谱PCA特征值的碎石图

2.3.3 正交偏最小二乘法-判别分析（OPLS-DA）将12 批寒喘祖帕颗粒样品共有峰的相对峰面积导入SIMCA-P 14软件进行OPLS-DA，结果见图6。OPLSDA模型得分图显示，寒喘祖帕颗粒样品可很好地聚类为3类，与聚类分析、PCA结果一致。以模型变量重要性投影（VIP）值为指标，将能够引起组间差异的成分进行分析，VIP图可反映出每个峰的贡献程度。VIP值＞1的色谱峰分别为13号峰（1.960 36）、6号峰（1.796 61）、1号峰（1.227 13）、7号峰（1.132 76），是引起寒喘祖帕颗粒批次间差异的主要标志性成分，其是区分样品最关键的色谱峰，对样品分类作用较大，见图7。

图6 12批寒喘祖帕颗粒样品的OPLS-DA得分图

图7 寒喘祖帕颗粒样品的VIP值结果（±s, n=12）

3 讨论

3.1 提取溶剂的选择

寒喘祖帕颗粒中所含化学成分较多，性质也各不相同，为在色谱图中更多地体现药材中含有的化学成分信息[4,19]。本研究通过查阅大量文献，最终选择了以水与50%甲醇作为溶剂，用这2 种溶剂对样品进行提取，得到供试品溶液。进样结果的色谱图可看出，50%甲醇和水分别为溶剂时，在同样的色谱条件下所得的HPLC 图基本一致，而以水提取的样品不易保存且不易过滤，综合考虑，最终选择50%甲醇作为提取溶剂。

3.2 检测波长的选择

本研究采用二极管阵列检测器，在相同色谱条件下，在波长190～800 nm 下进行扫描。分别选择了200、220、254、273、330、365 nm 波长下的色谱图进行比较，根据各个波长下呈现出的3D图谱和对应的波长下的平面色谱图，可以看出在220 nm 波长条件下所获得的供试品溶液的图谱能够显示更丰富的信息，且各色谱峰的分离效果也较好，故选择220 nm作为测定波长。

3.3 色谱条件的选择

考察了甲醇和乙腈作为流动相时不同梯度和等度对寒喘祖帕颗粒指纹图谱的影响。在等度分析甲醇与乙腈为流动相时，分离度均较差，为了使各色谱峰有较好的分离效果，选择梯度洗脱。通过对供试品液相图谱的对比，乙腈作为流动相时比甲醇作为流动相得到的色谱图出峰要多，而且通过对比这2 种流动相得到的不同图谱，发现在各色谱峰之间的分离度方面乙腈优于甲醇，故最终选择乙腈作为该研究的流动相。

3.4 分析方法评价

本研究建立了寒喘祖帕颗粒的HPLC 指纹图谱，确定了15 个共有峰，并对12 批样品进行相似度评价。结果显示，寒喘祖帕颗粒的HPLC 色谱指纹图谱具有良好的相似性。此外，本研究通过化学模式识别分析建立了聚类分析、PCA、OPLS-DA 分类模型，这3 种分析方法的结果基本一致。12 批样品通过聚类分析被分为3类；PCA得到前2个成分因子累积方差贡献率可达80.675%，第1 主成分的独立方差贡献率达到64.524%，主要反映了以甘草中代表性成分甘草苷、甘草酸铵为主的化学成分在质量控制中发挥了主要作用；OPLS-DA 以共有峰VIP 值＞1色谱峰为1、6、7、13 号峰，可能是区分样品的关键色谱峰。其中，1 号峰为没食子酸、7 号峰为甘草苷、13 号峰为甘草酸铵，上述3 种成分是寒喘祖帕颗粒中的活性成分，对寒喘祖帕颗粒的质量控制起着关键作用。

综上所述，本研究建立的HPLC 指纹图谱方法稳定可靠、重复性好，并建立化学模式识别分析方法，可为寒喘祖帕颗粒的质量评价与控制提供参考。