MicroRNAs在肝细胞癌中的作用机制及临床应用研究进展

刘昊天 徐剑锋 潘立鑫 王秋雁 向邦德 钟鉴宏

作者单位：南宁 530021 1广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科/区域性高发肿瘤早期防治研究教育部重点实验室（广西医科大学）/广西区域性高发肿瘤早期防治研究重点实验室；2广西医科大学基因组与个体化医学研究中心/广西基因组与个体化医学研究重点实验室/广西基因组与个体化医学协同创新中心

肝细胞癌（以下简称肝癌）是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，发病率在全球多个地区呈增长趋势，也是全球第二大肿瘤死亡病因［1］。肝癌的发生由环境、遗传和表观遗传等因素相互作用引起，慢性病毒性肝炎感染、饮酒、黄曲霉毒素暴露和代谢性疾病等是肝癌发生的主要危险因素［2］。近年来，尽管肝癌早诊早治的比例升高、手术与围手术期护理技术提高，以及晚期肝癌靶向和免疫治疗的兴起与普及等提高了患者的生存时间，但由于肝癌的高发病率、高复发率以及有限的治疗策略，其总体生存率仍不理想。因此，进一步探索肝癌发生发展的机制，对防治肝癌及改善患者预后具有重要意义。

随着医学及生物学技术的进步，microRNAs（miRNAs）逐渐成为肿瘤领域研究的热点之一。miRNAs主要参与介导蛋白质编码基因转录后的调控，在细胞生长、凋亡、分化以及免疫中发挥重要作用［3］。目前已有研究表明，miRNAs可作为致癌或抑癌基因参与肝癌相关基因表达的调控，进而影响细胞增殖、迁移、侵袭和耐药性等［4］。本文就近年来miRNAs在肝癌中的作用机制及其临床应用研究进展作一综述。

1 miRNAs与肝癌的关系

miRNAs是一类序列较短的非编码单链RNA（长度为19～25个核苷酸），首次发现于1993年，主要通过调控基因表达和细胞过程而在肿瘤中发挥重要作用［5］。研究显示，单个 miRNAs可靶向多个mRNAs，而多个miRNAs也可共同靶向一个mRNA，miRNAs还能调节包括多种与肿瘤相关的致癌或抑癌基因［6］。miRNAs在基因组上主要定位于与肿瘤相关的脆性位点和断裂位点。而编码与功能障碍相关的miRNAs的基因组区域可能发生突变、扩增、缺失或插入等遗传学改变，从而导致肿瘤发生［7］。多项研究表明miRNAs在包括肝癌在内的肿瘤发生发展中起关键作用［8-9］。部分miRNAs的转录受到致癌相关转录因子的激活，例如c-Myc，一种调节10%～15%人类基因的原癌基因，可通过与E-box结合激活miR-17-92的转录而在肝癌中发挥促癌作用［10］。部分miRNAs的转录受DNA甲基化和组蛋白乙酰化等表观遗传水平调控，例如在肝癌中，组蛋白去乙酰化酶通过抑制miR-449的表达发挥促癌作用［11］。此外，转录后调控也是控制miRNAs表达的重要方式。有研究表明，miRNAs加工成熟过程中 Drosha、DGCR8、Exportin-5、Dicer、TRBP 和 Ago等关键酶/蛋白的减少或缺失会减少成熟miRNAs的合成，从而导致肝癌的发生发展［12］。还有研究发现，miRNAs与不同的疾病状态如病毒性肝炎、脂肪性肝炎、肝纤维化、肝硬化等慢性肝病相关［13］。综上认为，miRNAs与肝癌密切相关，在肝癌的早期诊断、治疗及预后等方面有着广阔的应用前景。

2 miRNAs在肝癌中的作用机制

由于肝癌的高度异质性，以及由不同病因引起的肝癌复杂多变的免疫微环境，目前肝癌发生发展的确切机制仍未明确。研究表明miRNAs失调几乎涉及肝癌发生的全过程，其中大多靶向与肝癌癌变过程密切相关的基因和信号通路，见表1。即使在早期阶段，与健康人群相比，肝癌患者的miRNAs水平也表现出明显差异［14-15］。因此，研究miRNAs在肝癌中的作用机制能为肝癌的临床诊疗策略提供重要依据。

表1 miRNAs在肝癌中的作用机制

2.1 促癌作用

miRNAs可通过增强肝癌细胞增殖、迁移和侵袭能力而在肝癌的发生发展过程中起促癌作用。目前多种miRNAs被发现在肝癌中发挥促癌作用，在调控细胞增殖方面，CHEN等［23］发现miR-155-5p可通过靶向抑制CTHRC1的表达来激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进肝癌细胞增殖。在调控细胞凋亡中，LIU等［17］研究报道，miR-103a可通过靶向调控ATP11A和EIF5的表达，促进糖酵解代谢途径并抑制肝癌细胞凋亡，从而导致肝癌进展。WANG等［16］研究也显示，miR-21可在体外通过靶向KLF5 3′-UTR区抑制其表达从而促进肝癌细胞的迁移和侵袭。还有研究［30］报道，miR-145-5p可直接靶向结合SPATS2，从而抑制肝癌细胞侵袭和转移。

2.2 抑癌作用

在寻找肝癌致癌基因的同时，抑癌基因也成为研究的重点，目的是在肝癌进程中甚至在发生前抑制其发生发展。ZHANG等［24］研究发现miR-199a可通过负调节HK2和PKM2两个糖酵解关键因子抑制肝癌细胞中的糖酵解代谢，从而抑制肝癌细胞增殖。LI等［25］发现miR-199a-3p在不同类型的细胞中发挥不同的作用，其中可通过靶向抑制PDCD4进而抑制肝细胞凋亡和肝损伤，同时抑制肝癌细胞的生长。WANG等［26］报道，miR-195可通过靶向负调节VEGF、VAV2和CDC42的表达，从而抑制肝癌细胞的血管生成及转移。XU等［31］研究表明miR-195-5p可通过抑制PHF19的表达水平，从而抑制肝癌细胞增殖、迁移及侵袭。总之，miRNAs主要通过参与调控细胞增殖、侵袭转移、凋亡和自噬等途径对肝癌的恶性进程发挥抑制作用。

3 miRNAs在肝癌中的临床应用

3.1 miRNAs与肝癌诊断

寻找有效的肝癌早期诊断生物标志物一直是该领域学者努力的方向。目前，尽管临床上常用的标志物如甲胎蛋白（AFP）、异常凝血酶原（PIVKA-Ⅱ）等发挥了重要作用，但其敏感度和特异度仍不理想［32］。既往大量研究已显示了miRNAs在肝癌中的诊断价值。此外，miRNAs具有可在包括血清、外泌体、凋亡小体等稳定存在的特性，因此可能是早期肝癌较为理想的生物标志物［33］。WANG等［34］研究发现，在肝硬化、早期肝癌和晚期肝癌患者的组织和血清中miR-21依次显著上调，且在大鼠模型中发现血清miR-21的改变较AFP早，因此认为miR-21具有成为肝癌早期诊断生物标志物的潜力。FRÜNDT等［18］通过检测肝癌、肝硬化患者和健康个体血浆中的外泌体，发现miR-192、miR-146a和miR-16显著失调，其中miR-146a诊断肝癌的受试者工作特征（ROC）曲线下的面积（AUC）为0.800，敏感度为81%，特异度为78%，也在肝癌和肝硬化患者的早期诊断中显示了一定潜力。ZHANG等［19］研究发现，血浆中靶向TFF3的miR-203a-3p在肝癌患者中显著上调，且miR-203a-3p在诊断肝癌中表现出了良好的效能，AUC为0.860，敏感度为77.3%，特异度为75.1%。WANG等［35］在肝癌患者血清中检测miR-122和miR-148a的表达水平，也发现两个指标的表达水平均显著高于肝硬化患者和健康个体，但与慢性乙肝患者相比无明显差异。该研究还验证了miR-122、miR-148a单独和联合甲胎蛋白在区分肝癌和肝硬化中的诊断能力，结果发现三者组合的诊断效能最佳，AUC达0.931，敏感度和特异度分别为86.0%和87.5%。未来随着研究的深入，相信越来越多血浆或血清中与早期肝癌相关的miRNAs会被发现和应用，成为无创、快捷的早期肝癌诊断生物标志物。

3.2 miRNAs与肝癌治疗和预后

目前肝癌的治疗主要以手术切除、肝移植等根治性治疗为主，然而由于肝癌的高度异质性和免疫耐受，其总体疗效仍不能令人满意。既往研究发现与肝癌相关的miRNAs不仅可用于肝癌的预后预测，也可能是肝癌潜在的治疗靶点［36］。多项研究已证实miRNAs疗法能改变肝癌细胞中相应的miRNAs表达，从而调控关键mRNA的转录，进而抑制肝癌细胞增殖或诱导细胞凋亡［37-38］。因此，在肝癌中miRNAs靶向治疗的研究越来越受关注。有研究显示，约三分之一的肝癌患者存在β-catenin基因突变，miR-34a在肝癌组织和细胞中上调，且miR-34a在具有β-catenin基因突变的肝肿瘤中发挥了关键的致癌作用［20］。该研究还发现，锁定核酸（locked nucleic acid，LNA）修饰后的miR-34a能在无明显毒性的情况下，通过激活肿瘤抑制因子HNF-4α促进Caspase-2和Caspase-3调控的凋亡信号来发挥抗肿瘤作用，说明miR-34a可能是肝癌潜在的治疗靶标。KOTA等［39］报道miR-26a在肝癌组织中表达下调，且miR-26a可通过抑制肝癌细胞中的细胞周期蛋白D2和E2诱导细胞周期阻滞从而发挥抑癌作用；而用腺相关病毒载体将已修饰的miR-26a注入肝癌小鼠体内，发现可以抑制肝癌发展，且无明显毒副作用。说明腺相关病毒载体可用于输送miRNAs抑制剂或miRNAs前体，从而促进抑癌基因的表达或阻断靶基因的致癌能力，为基因治疗在实体瘤中的应用提供了可能。在预后预测方面，CHANG等［21］报道miR-487a在肝癌组织和细胞中表达上调，且其高表达水平与肝癌患者的不良预后相关，在小鼠体内经静脉注射miR-487a抑制剂可显著抑制小鼠体内肿瘤生长和转移。CAO等［22］在肝癌组织和细胞系中发现miR-182-5p均异常过表达且与微血管侵犯和甲胎蛋白相关，可能是肝癌患者的独立预后因子。还有研究发现，在经载药微球经肝动脉化疗栓塞治疗的肝癌患者中，血清中的miR-21、miR-122可能作为预后预测标志物［40］。综上，miRNAs已在肝癌治疗和预后评估中显示了良好的应用前景，但不同肿瘤细胞、不同肿瘤发展阶段中同一miRNAs可结合多个不同靶点，从而发挥不同乃至完全相反的作用，因此单一miRNAs在肝癌治疗和预后预测中的价值仍需探索。

3.3 miRNAs与肝癌的耐药性

肝癌治疗药物主要包括索拉非尼、仑伐替尼等分子靶向药物，顺铂、5-氟尿嘧啶等化疗药物，以及免疫检查点抑制剂在内的免疫治疗［41］。近年来，尽管肝癌的药物治疗取得了很大进展，但在杀死癌细胞的同时，这些药物也会通过激活Wnt/β-catenin等多个信号通路致使细胞对药物产生抗性［42］。多项研究表明，miRNAs可通过影响与细胞增殖和凋亡相关的基因影响肝癌的耐药性［43-44］。如ZHANG等［27］研究发现miR-374b通过拮抗PKM2介导的糖酵解途径使肝癌细胞恢复对索拉非尼治疗的敏感性。ZHAO等［28］也报道miR-338-5p可直接抑制或通过EGFR/ERK1/2信号通路间接抑制ABCB1的表达，从而增强肝癌细胞对阿霉素和长春新碱治疗的敏感性。近年来，放疗在肝癌治疗中也扮演了越来越重要的角色。SHAO等［29］研究发现miR-621能在体内外通过直接抑制SETDB1的表达并激活p53信号通路，从而增强肝癌细胞对放疗的敏感性。还有研究显示，miRNAs可调节肿瘤微环境中的免疫检查点分子的表达［45］，但miRNAs参与免疫检查点抑制剂耐药的具体机制尚不清楚。肝癌的耐药性仍然是影响患者长期生存的重要因素，因此阐明miRNAs调控肝癌耐药的机制将有助于预测和增强药物敏感性以及开发克服耐药性的治疗策略，从而改善患者预后。

4 小结与展望

miRNAs作为表观遗传调节因子不仅在肝癌的发病机制中起着至关重要的作用，在肝癌早期诊断、耐药性、治疗及预后判断中也表现出了广阔的应用前景。未来随着对miRNAs生物学功能及其与肝癌相关性研究的不断深入，更多的miRNAs有望被挖掘，从而为开发更有效的肝癌治疗策略提供新的靶点和思路。但是miRNAs与肝癌的研究也仍然面临着多个亟待解决的关键问题，例如miRNAs的研究目前大多仍处于基础研究阶段，且多数研究着重探索单个miRNAs在肝癌发展过程中的作用，无法动态识别和分析肝癌不同进展阶段，尤其是癌前病变微环境中miRNAs的作用及变化。此外，尽管miRNAs在肝癌的早期诊断和治疗中的地位与日俱增，但仍有部分miRNAs与肝癌缺乏相关性，因此仍需挖掘更可靠和敏感的肝癌相关miRNAs。同时，miRNAs治疗在临床应用中还面临着包括药物递送效率低、脱靶效应、有效剂量的确定以及安全性等问题。因此，继续深入探索miRNAs在肝癌发生发展中的具体分子机制，仍然是寻求新的治疗靶点和方法以及提高患者预后的重要途径。