尿毒症毒素对血管平滑肌细胞钙化影响的基础研究

段书众， 马思佳， 于文会， 张 岩， 贾兰芳， 董巧荣

(承德医学院附属医院肾脏内科， 河北 承德 067000)

血管钙化是慢性肾衰竭患者心脑血管事件的独立危险因素。高磷血症及高甲状旁腺素血症是慢性肾脏病患者普遍存在的代谢紊乱，是此类患者发生骨质疏松和血管钙化的关键因素[1]。肾小球滤过率下降和活性维生素D及成纤维细胞生长因子23水平的变化导致了钙磷代谢紊乱，细胞培养、动物模型以及临床研究均证实：钙磷代谢异常在血管钙化的发生和发展过程中发挥了重要作用。目前公认高磷血症是导致血管钙化发生的促进因素，可能涉及高磷血症导致血管平滑肌细胞向成骨细胞转分化、诱导血管平滑肌细胞凋亡以及升高血成纤维细胞生长因子23水平及降低Klotho表达[2]。但高甲状旁腺素在能否直接导致血管钙化方面仍存在争议[3]。该研究旨在评估高磷血症与高甲状旁腺素血症两个因素，哪个是血管平滑肌细胞钙化发生的独立危险因素。

1 材料与方法

1.1细胞培养及分组：在37℃恒温培养箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培养基，体外培养人胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)。每2d更换一次培养液，采用0.25%胰酶作为消化液进行细胞传代，应用第5～8代细胞进行试验。设置对照组、高磷组(β-甘油磷酸钠调整培养基内磷浓度为2.6mmoL/L，依据第3版《王海燕肾脏病学》血磷高于1.46mmoL/L为高磷血症。)、高甲状旁腺素a组(甲状旁腺素1-34浓度为10-11moL/L)、高甲状旁腺素b组(甲状旁腺素1-34浓度为10-10moL/L)；培养基培养14d，检测BMP-2及Runx-2表达。

1.2茜素红染色观察各组钙沉积情况：血管平滑肌细胞接种到9孔板中，按照实验分组给予干预措施，培养14d。弃去上清，PBS冲洗3次，4%甲醛于4℃固定10min，PBS冲洗3次，放入浓度为1%、pH值为4.2的茜素红溶液内染色20min，双蒸水冲洗，滤纸吸干后酒精脱水，相差显微镜下观察并拍照。观察到橘红色结节为钙盐沉积的阳性表现。

1.3实时定量PCR检测各组BMP-2、Runx-2基因表达：25cm2培养瓶内培养血管平滑肌细胞，PBS冲洗3次，使用TRIzol试剂盒，按照试剂盒说明书提取总的细胞RNA，测浓度。取RNA1μg，用反转录试剂盒逆转录出cDNA。取cDNA作为PCR扩增模板，按照说明书配反应体系，以GAPDH为内参基因。引物序列：①BMP-2,forward GGG ACC CGC TGT CTT CTA GT and reverse TCA ACT CAA ATT CGC TGA GGA C;②Runx-2,forward GAC TGT GGT TAC CGT CAT GGC and reverse ACT TGG TTT TTC ATA ACA GCG GA;③GAPDH,forward AGA AGG CTG GGG CTC ATT TG and reverse AGG GGC CAT CCA CAG TCT TC.

1.4Western blotting检测各组细胞BMP-2、Runx-2蛋白表达:75cm2培养瓶各组血管平滑肌细胞，PBS洗涤3次，应用RIPA缓冲液裂解细胞，BCA试剂盒测定蛋白含量。12.5%SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白组分，转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭60min，冲洗后于一抗孵育液内4℃过夜，TBST洗涤3次，与二抗(1∶5000)混匀，室温孵育60min。一抗浓度：anti-BMP2(1∶1000),anti-Runx2(1∶1000)and anti-β-actin(1∶5,000)。

1.5各组血管平滑肌细胞胞内钙含量测定：血管平滑肌细胞接种到6孔板中，按照实验分组给予干预措施，培养14d。细胞刮刀刮下细胞，加入5mLPBS冲洗混匀细胞，移入离心管后4℃ 1000转/min离心5min，移去上清液。加入200μL裂解液，转入离心管，震荡15s，于冰槽内静置30min后，4℃ 13000转/min离心5min，移去上清液至1.5mL离心管，吸取10μL用细胞钙离子定量试剂盒测定，酶标仪波长为570nm。

2 结 果

2.1茜素红染色检测各组细胞钙沉积(图1):空白对照组(control组)与高甲状旁腺素a组和b组未见钙化表现；高磷浓度组(HP组)血管平滑肌细胞被染成深红色，提示存在细胞钙化。

图1 PTHa和PTHb两种甲状旁腺素病理浓度组的细胞形态与control组比较，无变化，仍具有收缩型血管平滑肌细胞的长梭形或带状，并且茜素红染色无深红色钙化结节；HP组细胞形态已发生变化，且茜素红染色发现橘红色阳性钙化结节形成。

2.2RT-PCR检测各组基因表达(图2)，Western blot检测各组蛋白表达(图3)：空白对照组与高甲状旁腺素A组及B组血管平滑肌细胞BMP-2及Runx-2基因及蛋白表达量无增加，提示单独高甲状旁腺素无诱导血管平滑肌细胞钙化的作用；高磷浓度组血管平滑肌细胞BMP-2及Runx-2基因及蛋白表达量较对照组及正常磷浓度组明显增高，提示存在高磷诱导血管平滑细胞钙化。

图2 各组BMP-2和Runx-2基因表达

图3 各组BMP-2和Runx-2蛋白水平的表达

2.3各组细胞内钙离子测定结果：高磷组细胞内钙水平明显高于对照组(P=0.008<0.05)，提示高磷可导致细胞内钙异常增高，导致钙化；高甲状旁腺素a组与b组血管平滑肌细胞胞内钙离子浓度与对照组无差异(P>0.05)，见表1。

表1 各组细胞内钙离子测定结果

3 讨 论

血管钙化是一个主要由血管平滑肌细胞驱动的主动过程[4]，包括血管平滑肌细胞转分化为成骨样细胞、凋亡以及改变细胞外基质沉积以利于血管平滑肌细胞迁移等过程，因此该课题选择人主动脉血管平滑肌细胞为观察对象。Runx-2是血管平滑肌细胞向成骨细胞转分化的重要调节因子，在血管钙化过程中起关键作用；作为成骨配体的BMP-2既是血管钙化的标志物又是驱动剂。因此，该课题选择Runx-2和BMP-2为血管平滑肌钙化的监测指标。慢性肾衰竭患者血管平滑肌细胞肌浆网的钙泵表达减少，导致细胞内钙超载，导致细胞损伤、凋亡，促进钙化。细胞内钙水平变化是细胞钙化更为敏感的指标，因此本研究通过监测细胞内钙水平来反应不同干预因素对细胞钙化的影响。

血管平滑肌细胞转分化的过程伴随着细胞形态学变化：正常血管平滑肌细胞为收缩型，增殖、迁移能力差，细胞呈长梭形或者带状；当血管平滑肌细胞转分化为分泌型，则胞体增大，失去收缩型时的梭形或者带状，变得不规则，其合成和迁移能力增强。该课题光镜下观察发现：两种病理浓度的甲状旁腺素组细胞形态仍为梭形或者带状，提示细胞仍为收缩型，高浓度的甲状旁腺素未能成功诱导血管平滑肌细胞转分化；而高磷培养基细胞形态发生变化，提示血管平滑肌细胞已转分化为分泌型，是发生钙化的关键步骤。

该课题研究表明：高磷培养基可使血管平滑肌细胞BMP-2及Runx-2表达增加，茜素红发现高磷培养的血管平滑肌细胞钙沉积。慢性肾衰竭患者肾脏排磷功能减退，因此高磷血症是慢性肾衰竭患者一种常见的电解质紊乱，与慢性肾衰竭患者血管钙化、心血管事件增加有关。高血磷时，磷可通过血管平滑肌细胞的磷转运体进入细胞内，升高细胞内液磷浓度，使细胞内成骨性标志物Runx-2和BMP-2表达增加，进而促使血管平滑肌细胞由收缩型转分化为分泌型的成骨样细胞。发生转分化的细胞通过在局部生成促钙化的环境和钙磷沉积的位点等主动促进钙羟基磷灰石结晶沉积到血管中膜[5]。而细胞外高磷环境可诱导血管平滑肌细胞凋亡[6]，产生的凋亡小体可以提供钙磷沉积的内核[7]；同时高磷的环境会促使细胞外基质重构，血管平滑肌细胞分泌的基质金属蛋白增加，弹性纤维等细胞外基质蛋白降解，提供另一类钙磷沉积的位点。该研究的价值在于：证实了单独高磷即能够诱导血管平滑肌细胞钙化，不需要尿毒症毒素、高钙及高甲状旁腺素等因素参与，因此高磷是血管钙化的独立危险因素。既往也有文献支持：即使是肾功能正常的人，短暂的血磷浓度升高可导致血管内皮细胞功能紊乱；升高的血磷与冠状动脉钙化相关，增加心血管事件和死亡率。

中国人群血甲状旁腺素浓度区间为(37.07±14.29)ng/L[8]，按照其摩尔质量9500g/moL，换算摩尔浓度的正常范围为(2.4～5.4)×10-12moL/L；选择甲状旁腺素的两个病理浓度100pg/mL和1000pg/mL，换算为摩尔浓度分别为1.05×10-11moL/L和1.05×10-10moL/L。因此选择PTH(1-34)两组病理浓度分别为高甲状旁腺素a组10-11moL/L和高甲状旁腺b组10-10moL/L对血管平滑肌细胞进行干预。两种病理浓度的甲状旁腺素水平培养的血管平滑肌细胞均未出现钙化，钙化相关蛋白Runx-2和BMP-2的表达与对照组亦无差异，并且细胞内钙水平较对照组无变化。

甲状旁腺素在肾脏可以增加肾小管对钙离子的重吸收，加强磷的排泄，并使活性维生素D及成纤维细胞生长因子23生成增加；甲状旁腺素可以使肠道对钙和磷的重吸收增加。慢性肾衰竭患者，由于活性维生素D缺乏、低钙血症及高磷血症导致继发性甲状旁腺功能亢进。目前公认：继发性甲旁亢与慢性肾衰竭患者心血管疾病风险密切相关。然而患者体内存在众多的危险因素，临床上想要确定单纯甲状旁腺素对心血管疾病的影响是非常困难的[9]。因此有学者切除尿毒症大鼠甲状旁腺，通过皮下植入甲状旁腺素泵的方式控制血甲状旁腺素浓度，同时控制磷摄入，证实：甲状旁腺素可以不依赖磷而诱导血管钙化[3]。但这仍是尿毒症大鼠体内的实验，不能排除磷以外的尿毒症毒素参与血管钙化形成。而该研究运用简单方法，证实了：单纯甲状旁腺素不能诱导血管平滑肌细胞钙化，高甲状旁腺素并非血管钙化的独立危险因素。甚至有部分基础实验证实，甲状旁腺素通过某些机制抑制血管钙化的过程：PTH可增加血管平滑肌细胞cAMP的产生、促进钙外流，导致血管扩张；甲状旁腺素可通过蛋白激酶A和蛋白激酶C活性，增加一氧化氮合成酶的表达，使得血管内皮细胞产生一氧化氮增多，舒张血管；甲状旁腺素可通过抑制BMP2-Msx2-Wnt信号通路预防血管钙化。

随着认识的深入，目前公认为高磷血症是慢性肾脏病血管钙化的中心环节。因此临床工作中，需重视管理慢性肾脏病患者高磷血症。