外源2,3-丁二醇对匍匐翦股颖耐热性的影响

赵宁，史毅，马晖玲

（1. 甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，甘肃省草业工程实验室，中⁃美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州 730070；2. 甘肃农业大学林学院，甘肃 兰州 730070）

温度是影响草坪草生长发育及生态分布的重要环境因子［1］。在我国，草坪草应用存在北过渡带，该地区具有夏季高温高湿，雨热同期的气候特征［2］，处于此地区的冷季型草坪草受高温影响导致越夏困难，时常出现夏枯或短期休眠现象，在表观形态方面表现为草坪质量及密度下降［3］，细胞层面表现为植物细胞产生过量的活性氧，导致脂质过氧化，膜损伤，酶紊乱甚至细胞死亡［4］，这极大地制约了冷季型草坪草的地域发展。因此，提高冷季型草坪草越夏能力是亟待解决的问题。

匍匐翦股颖（Agrostis stolonifera）为禾本科翦股颖属冷季型草坪草，喜冷凉湿润气候，最适生长温度为15～24 ℃［5］，对高温的反应较为敏感，具有耐寒、耐瘠薄、耐践踏等特点［6］，由于其匍匐茎横向蔓延能力强，耐频繁低修剪［7］，叶片质地细密，绿期长，适应性强等优良特性［8］，被广泛应用于高尔夫球场果岭，网球场等高质量养护水平场地和园林绿化工程。

通过喷施外源物质来调控草坪草的耐热性，具有快速、高效的特点，对短期内快速增强草坪草的越夏能力具有重要作用［9］。2，3⁃丁二醇（2，3⁃butanediol，BD）作为一种挥发性化合物，常温下为无色无味的液体，具有安全无毒等特性，此外，它是一种新型诱抗剂，具有促进植物生长，提高植物非生物胁迫抗性的作用［10］。在重金属镉、盐碱、干旱等胁迫下，外源喷施BD 可有效减缓草坪草叶片相对含水量、叶绿素含量的损失速度，并在一定程度上提高植株氧化还原酶活性和渗透调节能力，缓解胁迫造成的氧化损伤，维持细胞膜的相对稳定性，从而提高草坪草的抗逆能力，使其能够更好地适应胁迫环境［7，10-11］。在温度方面，王振［4］研究发现在自然低温胁迫下，由于BD 的存在，同源异地的秋茄（Kandelia obovata）幼苗呈现出不同的适应性，含BD 等挥发性物质的植株对低温的适应性更强，氧化还原酶活性更高，说明BD 能提高秋茄幼苗对低温胁迫的耐受性。在高温胁迫方面，史毅［11］研究报道了BD 对草坪草热胁迫的耐受性有显著增强作用。

本研究以匍匐翦股颖Penn A4（Agrostis stolon⁃ifera‘Penn A4’）为材料，在室内盆栽条件下，于苗期喷施特定浓度的BD 溶液，测定高温胁迫下Penn A4植株生理生化指标的变化，初步探讨BD 对匍匐翦股颖耐热性的影响，为生产上应用外源BD 提高冷季型草坪草适应过渡带地区气候特征提供理论依据和技术支持。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料选用匍匐翦股颖Penn A4，千粒重为0.065~0.076 g，由北京克劳沃草业技术开发公司提供，产地为美国。供试试剂为2，3⁃丁二醇（主要成分为2，3⁃丁二醇，醇类试剂），购于山东西亚化工科技有限公司。

1.2 试验设计

1.2.1 种苗培育 先准确称取20 g 匍匐翦股颖PennA4 种子，蒸馏水浸泡24 h 后，用70%乙醇溶液处理1 min，再用20%的次氯酸钠溶液处理20 min，无菌水冲洗残液，处理完的种子自然晾干，备用。细沙和营养土以2∶1 比例的沙土混合物为基质，经150 ℃烘箱处理8 h，自然冷却，备用。

将灭菌后的种子按每盆1.7 kg/m3均匀播于小花盆中（长10 cm×宽10 cm×高12 cm），置于温度为23 ℃昼/20 ℃夜，光周期为16 h 光照/8 h 黑暗，光照强度2000 lx、相对湿度为50%的培养室中培养，每天喷施蒸馏水，出苗14 d 起，每周留茬高度2 cm，修剪后喷施1/2 Hoagland 营养液，40 d 后进行如下处理。

1.2.2 BD 及高温处理 试验共设定常温对照（H2O）、常温丁二醇（BD）、高温对照（H2O⁃H）、高温丁二醇（BD⁃H）4 个处理。植株生长40 d 后随机选取1/2盆栽，作为BD 处理组，叶面喷施BD 溶液（浓度为300 μmol/L），每盆约15 mL，每天1 次，连续处理3 d；1/2盆栽为对照组，喷施蒸馏水，每盆约15 mL，每天1 次，连续处理3 d。随后将上述BD 处理组和对照组分别随机平均分成两组，一组仍置于23 ℃昼/20 ℃夜，光周期为16 h 光照/8 h 黑暗的组培室中培养，为常温对照和常温丁二醇处理；另一组移至以37 ℃昼/32 ℃夜为高温胁迫的植物培养箱中培养28 d，为高温对照和高温丁二醇处理。胁迫期间丁二醇处理组种苗每隔14 d喷施BD 溶液（300 μmol/L），蒸馏水处理组种苗喷施蒸馏水。分别于热胁迫第0、7、14、21、28 天进行采样，采取供试种苗叶片进行相关生理指标的测定，每处理每指标3 个生物学重复。

1.3 测定内容及方法

1.3.1 植株表观形态观察 试验期间每天对各处理下的植株生长状况进行观察，并于每周采样完成后随机挑选1 盆各处理下的Penn A4 盆栽，以黑布为背景，整齐摆放为一排用手机拍照记录。

1.3.2 光合色素含量测定 取0.1 g 新鲜植物叶片，用95%的乙醇溶液遮光浸泡24 h，然后分别在470、649 和665 nm 波长下测定吸光度值。根据公式计算总叶绿素（Chlorophyll，Chl）、类胡萝卜素（Carotenoids，Car）含 量 和 叶 绿 素a/b（Chlorophyll a/b，Chla/b）值［12］。

1.3.3 细胞膜透性测定 用浸泡法［12］测定相对电导率（Relative conductivity，REC）；用硫代巴比妥酸法［12］测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量；用碘化钾分光光度法［13］测定过氧化氢（H2O2）含量。

1.3.4 抗氧化酶活性测定 采用氮蓝四唑法［12］测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）；采用愈创木酚法［12］测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）；采用紫外分光光度计法［14］测定抗坏血酸过氧化物酶（Ascor⁃bate peroxidase，APX）；采用紫外分光光度计法［12］测定谷胧甘肽还原酶（Glutathione reductase，GR）。

1.3.5 渗透调节物质含量测定 采用酸性茚三酮比色法［12］测定游离脯氨酸（Free proline，Pro）含量；采用考马斯亮蓝染色法［12］测定可溶性蛋白（Soluble pro⁃tein，SP）含量。

1.4 数据分析

采用SPSS 22.0 软件对所测数据统计分析，用平均值和标准误表示测定结果，分别对同一时间点不同处理进行单因素ANOVA 方差分析，并用Dun⁃can 法对各测定数据进行多重比较。采用Excel 2010作图。

2 结果与分析

2.1 BD 对高温胁迫下Penn A4 植株叶绿素降解的影响

对Penn A4 植株形态观察发现（图1），不同处理组植株叶片鲜绿程度随生长时间逐渐降低。常温组植株较高温组保持更旺盛的生长状态，处理组间无明显差异。高温组植株则生长迟缓，叶片发黄枯萎，且随胁迫程度的加深，枯萎症状更明显，与对照组相比，经BD 处理后Penn A4 叶片长势明显较旺盛，覆盖率更高，叶色鲜绿，有光泽。

与植株形态表现相对应，各处理下的Penn A4 叶片总叶绿素呈持续下降趋势（图2⁃A）。常温下处理组间Chl 无显著性差异（P>0.05）。热胁迫环境下Chl下降幅度更大，与图1 叶片鲜绿程度相一致，外源喷施BD 后Chl 下降幅度显著小于对照（P<0.05），并与常温组无显著差异，14~21 d，Chl 含量分别高出对照14.36%、20.90%。

图1 高温胁迫下Penn A4 表观形态Fig.1 The effect of BD on the morphology of Penn A4 under high temperature stress

Car 含量始终低于Chl 含量并随胁迫时间延长呈短暂升高后降低趋势，胁迫7 d 时Car 含量最高。常温下处理组间Car 无明显差异。高温处理14~21 d，BD组Car 显著高于对照且与常温组无差异，并分别高于对照13.89%、20.83%（图2⁃B）。

各处理下Chla/b 值均在21 d 时最低。正常温度下Penn A4 叶片Chla/b 变化幅度较小，处理组间差异不显著（P>0.05）。热胁迫下Chla/b 始终低于常温水平，经BD 处理后Chla/b 高于对照（≥14d），21~28 d内分别高于对照9.20%、4.50%（图2⁃C）。

图2 高温胁迫下Penn A4 叶片光合色素含量Fig.2 The effect of BD on the photosynthetic pigment content of Penn A4 leaves under high temperature stress

2.2 BD 对高温胁迫下Penn A4 细胞膜稳定性的影响

Penn A4 叶片REC 呈持续上升趋势，28d 时REC最高。常温下REC 上升幅度较小，两处理组变化趋势相一致。高温下对照组REC 自胁迫初期开始始终高于 常温组，BD 处理后REC 有效降低，7~14 d 内维持在常温水平，21 d 起较常温组达到显著水平（P<0.05），7~28 d 内，REC 分别较对照降低了14.85%、8.95%、9.90%、14.53%（图3⁃A）。

图3 高温胁迫下PennA4 的REC、MDA 及H2O2含量Fig.3 The effect of BD on the content of REC，MDA and H2O2of Penn A4 under high temperature stress

植株MDA 含量随处理时间的延长持续上升（图3⁃B）。常温下处理组间MDA 含量未达到显著水平（P>0.05）。胁迫环境下，高温促进了MDA 的积累，BD处理有效抑制了MDA 的增加，且胁迫时间越长抑制效果越显著，7~28 d，MDA 分别较对照降低了22.78%、9.72%、20.56%、26.43%。

PennA4 H2O2含量21 d 时达到峰值。常温下处理组间H2O2差异不显著（P>0.05）（图3⁃C）。热胁迫下H2O2含量显著积累（P<0.05），外源喷施BD 有效抑制了H2O2含量的升高，7、14、21、28 d 分别较对照降低了6.67%、7.14%、10.96%、10.00%。

2.3 BD 对高温胁迫下Penn A4 抗氧化酶活性的影响

常温下SOD 活性先升高后降低，处理组间差异不显著（P>0.05）。高温下SOD 活性先升高后降低再升高，BD 处理显著提高了胁迫14 d 的SOD 活性，7~14 d 分别较对照升高了21.11%、8.39%，14 d 后BD促进效果减弱（图4⁃A）。

不同温度下APX 活性呈不同变化趋势（图4⁃B）。常温下APX 活性逐渐降低，处理组间变化不显著。高温环境下APX 活性显著升高，BD 处理进一步增强了胁迫14 d 内的APX 活性，7~14 d 分别较对照升高了3.94%、13.81%。

图4 高温胁迫下BD 对Penn A4 SOD、APX 活性的影响Fig .4 The effect of BD on the activities of SOD and APX of Penn A4 under high temperature stress

常温生长的植株POD 活性先上升后降低，处理组间差异不显著（P>0.05）（图5⁃A）。高温下POD活性随处理时间先升高后降低再升高，胁迫处理28 d 前对照组活性与高温组差异不显著（P>0.05），经BD 处 理14 d 内POD 活 性 有 效 升 高，14 d时POD 活性是对照的1.24 倍。

GR 的活性在时间梯度上呈上升趋势（图5⁃B）。常温下处理组间GR 活性差异不显著（P>0.05）。高温胁迫提高了GR 活性，BD 处理进一步增强其活性（≥14 d），第14 d 时，较对照显著升高19.86%（P<0.05）。

图5 高温胁迫下Penn A4 的POD、GR 活性Fig .5 The effect of BD on the activities of POD and GR of Penn A4 under high temperature stress

2.4 BD 对高温胁迫下Penn A4 渗透调节物质的影响

常温下Pro 含量基本维持在稳定水平，两处理组变化幅度基本一致。高温下Pro 先升高后降低，7~14 d 内，高温抑制了Pro 积累，BD 处理后Pro 含量回升并与常温组无异，较对照分别上升22.69%、30.84%，21 d 时达到峰值（图6⁃A）。

4 种处理下，植株SP 含量变化不尽相同（图6⁃B）。常温下SP 含量呈波浪状变化，处理间变化不显著（P>0.05）。高温下SP 随处理时间逐步积累，BD 处理进一步提高了7~14 d 的SP 含量，较对照分别上升了39.45%、33.77%，14d 之后BD 组SP 含量升高幅度低于对照。

图6 高温胁迫下Penn A4 的Pro、SP 含量Fig.6 The effect of BD on the content of Pro and SP of Penn A4 under high temperature stress

3 讨论

3.1 BD 对高温胁迫下Penn A4 表观形态和光合色素含量的影响

叶绿素含量可反映植物的光合能力及抗高温能力，并与叶片表观形态变化密切相关，受高温影响［15］，在一定程度上高温会导致叶绿素生成量的减少，使其分解量大于生成量［16］，叶绿素a/b 反映了植物光能的利用效率，比率越高，利用效率越高［3］。类胡萝卜素作为叶绿素的后备补充，不仅能耗散叶绿素吸收的过多光能，起到光损伤防护功能，还可以清除活性氧［17-18］。本研究中，Penn A4 叶片随热胁迫时间延长逐渐萎蔫黄化，Chl、Car 及Chla/b 较常温水平持续降低，BD 处理后，其下降幅度显著降低，叶色持绿性更久。高温下叶绿素含量降低一方面是高温影响叶绿素生物合成的中间产物氨基酮戊酸和原卟啉Ⅸ的合成，另一方面高温诱导产生的活性氧易发生氧化破坏，使内囊体膜上的叶绿素降解酶活性增强［19］。外源亚精胺抑制高温下黄瓜（Cucumis sativus）幼苗高能态氧化物质的形成，降低了活性氧对叶绿素氧化破坏的风险，保护类囊体结构不受损伤，并抑制了叶绿素降解酶活性升高［20］。由此我们推测BD 保持了类囊体膜结构的稳定性，保护了Chl 生物合成场所，并抑制了叶绿素降解酶活性升高，从而维持了胁迫环境下较高的Chl 含量，还促进了Chlb 向Chla 的转化，最终获得了较高的光能利用率，保证了光系统Ⅱ活动的正常进行，而Car 升高是为了清除热诱导产生的活性氧来进一步维持生物膜的稳定性，同样，叶面施用磷酸二氢钾和蔗糖通过提高夏季红叶桃（Rhus chinensis）光系统Ⅱ活性和光能转换效率提高了光合能力，但与本研究不同的是，外源物质的施用反而降低了其叶片Chl、Car 含量［21］，这可能跟诱导剂类型有关。

3.2 BD 对高温胁迫下Penn A4 细胞膜稳定性的影响

质膜是活细胞与环境之间的界面与屏障，高温可直接有效地改变膜的渗透性和流动性：一方面高温改变了膜脂组成，使蛋白质变性，细胞器内膜系统的完整性被破坏，膜上离子载体的种类和功能发生改变，最终导致膜的选择性吸收功能丧失、电解质渗漏、相对电导率增加［22］；另一方面高温可诱导单线态氧、自由基、过氧化氢等活性氧累积，促使膜脂中不饱和脂肪酸脂膜过氧化为丙二醛，它能交联各类物质发生链式聚合反应，使酶蛋白失活对植物体造成伤害［23］。本研究中H2O2随高温呈先上升后下降的变化趋势，MDA 及REL 值则持续升高，外源喷施BD 则有效抑制其含量的升高，研究表明，高温下外源硝普钠、γ-氨基丁酸的施用使茄子（Solanum melongena）及高羊茅（Festuca elata）上述指标表现出与施用BD 类似的变化，主要源于外源物质提升了植物自身渗透调节能力、酶促及非酶促物质的清除功能，从而有效维持了膜系统的相对稳定性，缓解了氧化损伤，提高了植株耐热性［24-25］。因此，笔者认为，BD 对膜系统的保护作用也跟渗透调节物质以及酶促物质活性有关。

3.3 BD 对高温胁迫下Penn A4 抗氧化酶活性的影响

植物在高温下受到氧化胁迫时会启动活性氧清除系统来维持细胞内环境的稳定性，抗氧化酶（SOD、POD、APX、GR 等）是其抵御活性氧损伤的第一道防线。SOD 是H2O2的生成酶，可以催化O2∙-分 解 为H2O2和O2，POD 能催化H2O2与酚类的反应，从而减少活性氧的积累［26］，APX、GR 也起到类似的作用［27］。本研究中，热胁迫下Penn A4 各个酶活性均不同程度累积，并呈先上升后降低趋势，施加BD 后酶活性进一步增强（≥14 d），其中SOD 活性的谷值对应H2O2含量的峰值，APX 活性始终显著高于常温组（P<0.05），POD、GR 活性变化幅度则较APX 小，可见SOD 酶逐渐 消 耗 用 于 生 成H2O2，APX、POD 和GR 用 于 清 除H2O2，其中APX 发挥着主导作用。抗氧化酶活性不仅与物种相关，还与胁迫处理时间有关［28］，有研究报道，高温对匍匐剪股颖的抑制，前期主要是影响气孔开度，而后期则主要是影响氧化还原酶活性［29］，樊婕等［30］发现，逆境胁迫条件下抗氧化酶活性的增加具有一定的时间效应。由此我们认为胁迫前期（≥14 d）酶促防御系统并未被激活，外源BD 的干预提前活化了活性氧清除酶，从而有效缓解了前期植株的氧化损伤，而对照植株由于没有外界因素的调节活性氧随胁迫时长大量累积，少量的活性氧可作为信号分子调控细胞生长发育以及适应环境变化，过量的ROS 则会引起氧化应激［31］，因此，胁迫后期其所承受的氧化损伤远远大于BD 组植株，而植物自身为了保持良好的生存状态，激活了酶促防御系统，从而导致胁迫后期对照组酶活性高于BD 组。但曹语等［32］发现，短期高温可诱导抗氧化酶活性的提高，长期高温下细胞膜受损，酶变性失活，最终导致酶活性降低，喷施γ-氨基丁酸可使处理中后期茶树（Camellia sinensis）叶片抗氧化酶活性提高，这与本研究结果相悖，可能跟试验条件、物种、诱导剂种类等因素有关。

3.4 BD 对高温胁迫下Penn A4 渗透调节物质的影响

可溶性蛋白质具有增强植物耐脱水能力、保护细胞结构、清除活性氧并且延缓衰老的功能［33］，脯氨酸积累能防止植物水分散失，提高原生质胶体的稳定性，减轻高温下蒸腾加剧导致的伤害；并能增强蛋白质稳定性，保护膜结构；同时能为胁迫加重环境下植物的生长提供营养物质［34-35］，其积累速度和数量同牧草的叶片水势、萎蔫程度以及气孔开度等有关［36］。短期高温下，芝麻（Sesamum indicum）通过提高自身蒸腾失水启动降温机制，诱导了气孔开放；长期胁迫下，为了减少自身水分大量蒸发，保持细胞内部膨压，诱导了气孔关闭［37］，褪黑素的施用提高了菊花（Chrysan⁃themum morifolium）气孔导度并促进了渗透物质的合成，降低了有毒物质的累积［38］。本研究中，热胁迫前期对照组Pro、SP 较常温组无明显差异，经BD 处理后Pro、SP 明显升高（≤14 d），胁迫后期Pro、SP 均显著累积，对照组含量高于BD 组，可见短期高温抑制了Pro 合成，BD 打破了这种抑制，促进了胁迫前期Pro、SP 的累积，以提高因气孔开放降低的叶片水势，维持细胞膨压和膜稳定性；脯氨酸具有高度的吸湿性，可抵制氧化和水解产生的有毒物质［34］，胁迫后期膜透性增强，MDA 等有毒物质大量累积，对照植株受热应激影响Pro、SP 累积以清除MDA 及活性氧，减轻植物热损伤并为其应对长期胁迫提供能量，BD 组植株所遭受的损伤较小，所以Pro、SP 低于对照，这也反映出BD 诱导具有时间效应，而水杨酸对高温下皖贝母（Fritillaria anhuiensis）渗透物质累积的促进作用同样具有时效性［39］。

4 结论

高温胁迫下，叶面喷施300 μmol/L 的BD 可减缓光合色素降解速度，抑制叶片电解质外渗，降低MDA、H2O2含量，提高胁迫前期（≤14 d）抗氧化酶（SOD、POD、APX、GR）活性和渗透调节物质（Pro、SP）含量，维持膜结构的稳定性和活性氧的代谢平衡，增强Penn A4 幼苗耐热性。从而缓解了高温造成的氧化损伤，提高了匍匐剪股颖耐热性。