野牛草ISSR 分子标记体系的优化及遗传多样性分析

袁红，王羽玥，郭爱强，刘凌云，范希峰，武菊英

（1. 天津滨海国际机场有限公司，天津 300300；2. 北京市农林科学院，北京 100097）

野牛草（Buchloe dactyloides），禾本科画眉草亚科野牛草属，多年生暖季型草，多为雌雄异株，原产北美干旱半干旱矮草原［1-2］。20 世 纪40年 代 作 为 水 土 保持植物引入我国，表现出良好的适应性。野牛草具有叶片质地柔软、植株低矮、匍匐茎广泛延伸等特点，更由于其极强的耐旱性，目前广泛应用于草坪地被、园林绿化、固土护坡等［3］。当前对野牛草的研究主要集中在品种选育［4］、抗逆生理［5-7］及表型鉴定［8］等方面。而目前在遗传多样性研究上，存在资源少、方法不完善等问题，因此，进行分子标记方面的研究愈发必要。

前人利用同工酶谱、随机扩增多态性DNA 标记（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、序列相关扩增多态性（Sequence⁃related amplified polymor⁃phism，SRAP）和简单重复序列区间扩增（Inter simple sequence repeat，SRAP）对野牛草开展了遗传多样性的研究，探析了部分种质资源的遗传多样性。李永祥［9］通过RAPD 分子标记和幼叶PPO 同工酶谱两种方法对野牛草雄性植株早期性别鉴定。周莹洁［10］通过分子标记在雌性植株中找到特异性条带，但筛选标记的工作量及材料的不确定性仍造成了野牛草性别鉴定的困难。成凯凯等［3］通过ISSR 分子标记对美国及中国收集的30 份野牛草资源进行坪用性状的观测及遗传多样性分析，证明ISSR 一定程度上可以揭示野牛草材料的遗传背景。

ISSR 作为分析遗传多样性的一种简便快捷的方法，被广泛应用到种质资源鉴定、辅助育种选择、遗传图谱建立等领域［11］。ISSR 标记具有操作简单、可靠性强、重复性高、DNA 模板用量少、不需预先设计引物的特点，可用来揭示样本间的遗传多样性［12-13］。近年来，已在鸭茅（Dactylis glomerata）［14］、黑麦草（Lolium persicum）［15］及早熟禾（Poa annua）［16］等禾本科草上广泛应用。尽管ISSR 分子标记在野牛草中的应用已有报道，但是在实际操作的过程中，扩增体系及条件受多因素影响，存在一定的局限性，因此需要根据实验室的客观条件进行优化。

天津滨海国际机场东跑道升降带中分布有野牛草资源，经过多年驯化形成了数个零星分布的斑块状草坪群落。连续多年观测发现其中一个纯雌株群落表现出非常强的适应能力，且具备植株低矮、不结籽、病虫害少、抗逆性强等符合机场安全运行和鸟击防范要求的多重特征。但该材料遗传背景不清，且量小，不足以支撑生产和推广。为进一步明确其遗传信息，筛选相近的种质资源进行扩繁，提升机场绿化和鸟防效果，本研究利用ISSR 标记探析其遗传背景。首先优化ISSR 体系，主要包括TaqPCR Mix、引物、模板DNA 的配比及PCR 反应体系的摸索。然后通过ISSR 分子标记的方法对收集的39 份野牛草资源进行遗传多样性分析，并选择亲缘关系相近、性状优良的材料用于后续的生产扩繁。

1 材料和方法

1.1 材料

实验材料为课题组收集到的39 份野牛草资源，收集地包括天津滨海国际机场、中国林业科学院、中国农业科学院和北京市农林科学院等保存的野生种及6份商品化材料（表1）。

表1 39 份野牛草材料来源Table 1 Background information of the 39 buffalograss germplasms

实验试剂：CTAB 溶液、DNA Marker、PCR Mix（天根）、琼脂糖凝胶、Goldview 等。ISSR 引物为加拿大的不列颠哥伦比亚大学公布的序列［17］，本研究选用UBC808、UBC834、UBC836、UBC840、UBC841 和UBC889，由睿博生物工程有限公司（北京）合成（表2）。

表2 ISSR 通用引物名称及序列信息Table 2 Name and sequence of ISSR primers

1.2 方法

1.2.1 野牛草基因组DNA 的提取 参照CTAB

法［18］改良后进行野牛草基因组DNA 的提取。用1%的琼脂糖检测DNA 质量，用紫外分光光度计检测所提DNA 的 浓 度 及OD值。 将DNA 统 一 稀 释 到20 ng/μL，存于-80 ℃冰箱备用。

1.2.2 ISSR体系的建立及优化 本实验体系中主要影响因素为TaqPCR Mix、模板DNA、引物浓度，其次为PCR过程中的退火温度、循环数及延伸时间等。

根据实验室对苔草SSR 分子标记体系的探究［19］，本实验野牛草PCR 反应体系根据3 因素的3 个水平设计正交实验（表3，4），剩余用ddH2O 补齐，配制总体积为10 μL 的反应体系。随机引物选取UBC808。

表3 野牛草ISSR 体系因素水平设计Table 3 Experiment design of ISSR system factors of buffalograss

PCR 扩增体系为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34 个循环；72 ℃继续延伸10 min；4 ℃保存。PCR 产物通过1%的琼脂糖凝胶进行分离，并在凝胶成像系统拍照保存。

表4 野牛草ISSR 体系正交设计实验Table 4 Orthogonal experiment design of ISSR system of buffalograss

1.2.3 PCR 扩增体系优化 根据上述操作得到反应的最佳体系配比，并以此进行退火温度的梯度摸索。由于不同引物的最佳退火温度不同，这里以UBC808为例，选取野牛草品种“中坪1 号”，设置3 个梯度分别为48、51、54 ℃，进行最佳退火温度的确定。

1.2.4 数据分析 对获得的琼脂糖凝胶结果进行人工读带，在同一Marker 大小下，39 份样品的扩增结果有条带记为“1”，无条带记为“0”，统计所有引物下的条带，形成原始数据矩阵表。利用NTSYS Version 2.1［20］及POPGENE 32［21］计 算 遗 传 参 数，并 绘 制UPMGA 遗 传 信 息 聚 类 图［22］。根 据 公 式PIC=1-∑jiPij2［23］计算多态性信息含量（PIC），其中Pi表示第i个位点的等位基因频率，Pj表示第j个位点出现的频率。

2 结果与分析

2.1 野牛草ISSR 体系优化结果

野牛草ISSR 分子标记以TaqPCR Mix、模板DNA、引物浓度为因素，每个因素设计3 个水平，正交试验共得到9 个实验组合。根据PCR 产物的琼脂糖凝胶结果（图1），9 个组合均得到多态性条带，根据各成分用量的不同扩增结果出现不同程度的差异。其中，1~3 号条带模糊，4~9 号均扩增出清晰条带。以5号和9 号的扩增效果最佳，考虑成本问题及模板的用量等，以5 号体系为基础进行后续PCR 反应条件的优化。

图1 正交实验1~9 组合扩增结果Fig.1 Amplification results of orthogonal test combination

不同退火温度得到的扩增结果显示，产物条带在退火温度为48 ℃时最亮，51、53 ℃时差别不明显，但较48 ℃的条带相比较弱（图2）。

图2 退火温度为48、51 和53℃的扩增结果Fig.2 Amplification results at annealing temperature 48，51 and 53 ℃

最终确定的优化体系为10 μL 体系，其中包括5.0 μL Mix、20 ng/μL 的DNA 模 板2 μL 以 及 引 物0.6 μL，并以94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34 个循环；72 ℃继续延伸10 min；4 ℃保存的PCR 扩增体系扩增，可以作为其余39 份样品的ISSR 分析的基础。

2.2 遗传多样性分析

通过筛选前期合成的ISSR 通用引物，最终确定6对引物对39 份野牛草材料进行遗传多样性分析。PCR 产物通过琼脂糖凝胶电泳，共扩增出39 条条带（部分扩增结果见图3），产物条带的分子量分布在500~2 000 bp。利 用NTSYS-PC V2.1 软 件，分 析得到野牛草材料间的平均遗传距离为0.428，遗传相似系数为0.572。使用POPGENE 32 计算分析了观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、基因多样性指数（H）以及Shannon 信息指数（I）（表5）。多态性信息含量平均为0.303，在0.250~0.500，遗传多样性参数显示野牛草材料之间的遗传多样性处于中等水平，遗传基础较宽。

表5 39 份野牛草材料的遗传多样性参数Table 5 Genetic diversity parameters of the39 buffalograss

图3 引物UBC836 对39 份野牛草材料的扩增结果Fig.3 Amplification results of primer UBC836 among the 39 buffalograss materials

2.3 聚类分析

对39 份野牛草材料的ISSR 数据进行UPGMA 聚类分析，共分为两大类，其中27 号和28 单独聚为一类，其余36 份被聚到一类（图4）。其中与机场收集到的1 号材料亲缘关系较近的为21 号、9 号和3 号，24 和25 号亲缘关系最近。聚类分析表明39 份野牛草具有明显遗传背景的差异，在遗传距离为0.47 时，可将其划分为6 组，其中第1 组包含22 份材料，其中包括10份雌株，5 份雌雄株，占该组的68.2%；第2 组7 份雄株，2 份雌雄株，占该组的75.0%，可以大致上对雌雄株进行粗略的划分。同时采集自天津机场的1-6 号材料可以聚到一类，但同时也混合了采集自北京的材料，说明地域来源对其的影响不大。

图4 39 份野牛草材料遗传多样性分析Fig.4 Genetic diversity analysis of the 39 buffalograss germplasms

3 讨论

本研究提供了一种快速高效的野牛草ISSRPCR 反应体系，相比于张晓波等［24］对ISSR 体系探究，本研究用到的正交设计实验可以较快的找到最佳组合，并使用含有高纯度的TaqDNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液等物质的预混液TaqPCR Mix，在提高实验效率的同时，也减少了dNTP、Taq酶及Mg2+的配比对体系的影响。具有快速简便、灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。

引物的退火温度也是影响体系的重要因素。在芒草（Miscanthus sinensis）中ISSR 通用引物的退火温度 为52~54 ℃［25］，苔 草 属（Carex）植 物 为51~55 ℃［17］，本研究确定的最佳退火温度为48 ℃，与其他研究相比偏低。周少云等［26］提出不同植物材料的退火温度存在差异，针对不同的植物材料还应通过梯度试验进行最终确定。

尽管ISSR 分子标记技术已十分成熟，但具体到某一植物材料仍需进行体系的摸索与探究。野牛草是暖季型草坪草中的重要研究材料，应用前景广阔［27］，因此本研究同时关注野牛草材料的收集与遗传多样性分析，为野牛草育种应用、遗传改良等提供分子基础。

通过遗传多样性及聚类分析，本研究挑选21 号种质资源进行后续的扩繁实验，根据刘莉［28］对20 株野牛草进行的表型及ISSR 分析得到，聚类结果与形态特征没有明确的相关关系，所以在肉眼识别的外观性状均优良的条件下，可以选择与目的材料遗传距离较近的材料扩繁。本研究中的平均遗传距离为0.428，低于SRAP 标 记的0.669［1］，说明 本 研 究 用到的39 份野牛草材料更具相似性。

地域对种质资源的聚类有一定影响，但并未在本研究中体现，这与周莹洁等［1］来自3 个国家的31 份野牛草材料进行UPGMA 聚类发现的结果一致。本研究中并未发现地域对分类规律的影响原因可能有以下两点：一是收集地少，并且地域距离较近，具有相似的生境；二是收集的材料不具有地域的代表性，可能为引种或者商品化品种。

通过UPGMA 聚类并未完全对雌雄株进行清晰的划分，原因之一是本研究的目的是寻找与机场雌株遗传背景相似的材料进行扩繁，并未特意对可以鉴别雌雄株的ISSR 引物进行筛选；二是ISSR 可能不适合对野牛草进行性别鉴定，需要研究开发不同类型的分子标记进行研究。

4 结论

确定野牛草的ISSR 最佳反应体系为：5.0 μLMix、40 ng DNA 模板、0.6 μL 引物（1.0 μmol/L）及ddH2O 补齐。最佳扩增条件为94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 min，共34个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。将39 份野牛草材料的遗传多样性进行聚类分析，材料可分为两大类，其中21 号材料和天津滨海国际机场候选雌性野牛草材料的亲缘关系最近，可以作为后续材料扩繁和生产的种质资源。本研究中ISSR 体系的探索与优化、遗传多样性分析为野牛草遗传多样性分析工作提供了依据。