口腔胶原膜对两种骨再生相关细胞的作用

2022-09-05康文亭周立伟钟梅玲朱勇军李丽花欧阳翔英

口腔材料器械杂志 2022年3期

康文亭周立伟钟梅玲朱勇军李丽花欧阳翔英

（1. 深圳兰度生物材料有限公司，广东省医用高分子植入材料工程技术研究中心，深圳 518107；2. 香港大学深圳医院口腔科，深圳 518053；3. 北京大学口腔医院牙周科，北京 100081）

引导骨组织再生术（guided bone regeneration，GBR）是临床上牙种植时骨量不足而进行骨增量的重要技术，其原理是将膜材料放置于骨缺损区与软组织之间形成物理屏障，阻止迁移速度较快的成纤维细胞长入骨缺损区干扰骨形成，允许迁移速度较慢的成骨细胞优先进入骨缺损区，为骨组织再生创造相对封闭的空间[1，2]。屏障膜是GBR技术成败的关键因素之一，临床上早期应用的聚四氟乙烯膜、钛膜等不能降解，必须在后期行单独的移除手术，且使用此类膜后手术切口易开裂，致使感染风险增加[1，3，4]。后兴起的可吸收胶原膜由于能够逐渐被人体吸收，所以无需二次手术取出，极大减轻了患者的痛苦。胶原是细胞外基质的主要成分，胶原膜具有良好的生物相容性、低免疫原、可操作性和牙龈成纤维细胞的趋化性等优点[5，6，7]，在临床受到越来越多的关注，并已被广泛应用。

屏障膜在GBR 中发挥着不可替代的作用。理想的屏障膜不仅要具有防止成纤维细胞进入骨缺损部位的屏障作用，同时要能够促进成骨细胞的黏附、增殖和骨组织的再生[8]。由猪膜组织经脱细胞工艺制成的胶原膜，具有双面结构，即一面致密光滑，一面疏松粗糙。光滑面起屏障作用，使用时朝向软组织，可阻止软组织进入骨缺损区；粗糙面使用时朝向骨缺损区，有利于成骨细胞黏附，稳定血凝块，促进骨组织生成。本研究旨在根据此种胶原膜的预期功能，观察其光滑面对成纤维细胞的屏障作用，以及粗糙面对成骨细胞的黏附增殖作用，为其临床应用提供基础研究依据。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和设备

L929 小鼠成纤维细胞和MC3T3 小鼠成骨细胞由深圳市药检所提供。培养细胞所使用的MEM培养基、胎牛血清、青霉素/链霉素均购自Gibco公司，细胞染色处理时所用的鬼笔环肽-罗丹明和DAPI 试剂均购自Sigma 公司，甲醛为分析纯级别，购自国药集团。实验主要仪器：二氧化碳培养箱（Thermo 公司），倒置荧光共聚焦显微镜（德国 LEICA DMIL LED），扫描电镜（日立TM3030 TESCAN MIRA3）。

1.2 材料制备

选取经过防疫检验合格的健康猪膜组织，剔除粘连的脂肪后，先用胰酶和7% NaCl 溶液交替处理3 次，再用1% NaOH 溶液浸泡12 h，然后用PBS 多次浸泡清洗，最后用乙醇脱水，真空干燥。此工艺制备的胶原膜无化学交联，成分主要为Ⅰ型胶原。

1.3 材料与细胞共培养

胶原膜一面是光滑面，另一面是粗糙面。无菌环境下，将胶原膜裁切成直径为8 mm 的圆片，再经紫外照射30 min，备用。

胶原膜与L929 成纤维细胞共培养：将膜圆片平铺于48 孔板中，取100 μL 浓度为1×105个/mL 的细胞悬液分别滴加于膜片的光滑面或粗糙面表面，待完全湿润后，置于37℃ 5% CO2培养箱培养30 min，之后再加入约0.5 mL 不含细胞的培养基，再继续放置在培养箱中培养。根据细胞生长情况2 ～ 3 d 更换一次新鲜培养液。培养3 d、7 d、14 d 后，用PBS 轻轻洗去没有贴附在材料表面的细胞，清洗2 遍，用4%甲醛PBS 溶液（pH=7.4）固定，4℃下固定4 h 以上，备用。

胶原膜与MC3T3 成骨细胞共培养：将膜圆片平铺于48 孔板中，取100 μL 浓度为2×105个/mL 的细胞悬液滴加于膜片的粗糙面表面，待完全湿润后，置于37℃ 5% CO2培养箱培养30 min，之后再加入约0.5 mL 不含细胞的培养基，再继续放置在培养箱中培养。根据细胞生长情况2 ～ 3 d更换一次新鲜培养液。培养14 d 后，用PBS 轻轻洗去没有贴附在材料表面的细胞，清洗2 遍，用4%甲醛PBS 溶液（pH=7.4）固定，4℃下固定4 h 以上，备用。

1.4 激光共聚焦显微镜观察

将上述细胞共培养制备的胶原膜材料用PBS浸泡清洗两次后，再依次用5 μg /mL 鬼笔环肽-罗丹明、2 ng/mL DAPI 进行染色处理，避光保存，激光共聚焦显微镜下观察。

1.5 扫描电镜观察

观察胶原膜微观形貌：取上述1.2 制备的胶原膜，裁切成合适尺寸，贴样喷金120 s，SEM 观察两个表面及截面的微观结构。

观察胶原膜表面培养的细胞：将上述1.3 制备的细胞共培养材料用PBS 浸泡清洗两次后，放置于-60℃冰箱中15 min，再冷冻干燥12 h，贴样喷金120 s，SEM 观察细胞形态。

2 结果

2.1 胶原膜的微观结构

本研究制备的脱细胞胶原膜具有双面结构，即一面较致密的光滑面，一面较疏松的粗糙面，其微观形貌如图1 所示。膜片两面的纤维结构特征明显：光滑面纤维结构排列整齐紧密，纤维之间空隙宽度小于10 μm；粗糙面纤维结构排列交错疏松，空隙相对较大。

2.2 膜片光滑面对成纤维细胞的屏障作用

成纤维细胞在胶原膜的光滑面培养3 d、7 d、14 d 后的激光共聚焦荧光图和扫描电镜图（图2）显示，随着培养时间的延长，细胞不断增殖，胞体间伸出突起连接成片，有明显的基质分泌，3 d时细胞在膜表面能良好附着，细胞伪足清晰可见，7 d 时细胞增殖明显，且多呈长梭形，胞质充足，14 d 时细胞继续增殖，细胞间排列紧密，细胞多呈圆形，荧光图像和扫描电镜图像观察到的细胞增殖趋势一致，表明成纤维细胞能够在胶原膜光滑面良好附着并增殖。

从膜片的纵切面观察成纤维细胞向膜内部的生长情况（图3）。将细胞接种在膜光滑面后，从纵切面观察到的扫描电镜图和激光共聚焦荧光图（图3a-f）显示，成纤维细胞接种在膜片光滑面后，细胞仅沿着膜表面生长，没有向膜内部迁移。培养3 d 时，扫描电镜图和荧光图几乎都没有观察到细胞，培养7 d 时细胞数量明显增多，培养14 d时细胞已连接成片，增殖趋势与从表面观察到的增殖趋势吻合。将细胞接种在粗糙面后，从纵切面观察到的激光共聚焦荧光图（图3g-i）显示，细胞并没有聚集成一层，而是表现出向膜内部迁移的趋势。对比表明，胶原膜的光滑面对成纤维细胞起到明显的屏障作用。

2.3 膜片粗糙面对成骨细胞的黏附作用

将MC3T3 成骨细胞接种于胶原膜的疏松粗糙面并于体外共培养14 d 后，荧光显微镜观察结果（图4a）显示：成骨细胞骨架充分铺展，细胞质充足，细胞生长状态良好；扫描电镜观察结果（图4b）显示：成骨细胞黏附于膜粗糙面的胶原纤维上，细胞扁平呈星型，伸出片状伪足，生长状态良好，表明成骨细胞能够良好黏附在胶原膜的粗糙面。

3 讨论

脱细胞胶原膜是将动物组织中的细胞去除，而保留细胞外基质的一种天然材料，主要成分为胶原。此类材料除无毒、无抗原性外，还具有良好的生物相容性。由于在制备过程中保留了胶原的三维结构，所以胶原膜还对成纤维细胞和成骨细胞等再生细胞具有趋化作用，利于细胞的迁移增殖以及机体的创伤修复[9]。此类屏障膜的代表为瑞士公司生产的Bio-Gide，此产品也是目前临床在GBR 手术中应用最多的屏障膜。本研究中制备的胶原膜与Bio-Gide 非常相似，均是由猪膜组织经脱细胞等工艺制成，无化学交联，且同为双面结构，一面致密光滑，一面疏松粗糙，使用时光滑面起屏障作用，朝向软组织，可阻止软组织进入骨缺损区，而粗糙面朝向骨缺损区，有利于成骨细胞黏附，稳定血凝块，促进骨组织生成。在对Bio-Gide 基础研究中，马超[10]等将成骨细胞分别接种在Bio-Gide 粗糙面和光滑面，对比观察到光滑面可阻挡成骨细胞向膜内部迁移，由此初步评价了Bio-Gide 的屏障作用。本研究以此为参照，并根据产品实际使用情况，选用成纤维细胞初步评价了所制备的脱细胞胶原膜的屏障效果，同时还选用了成骨细胞评估了其在膜粗糙面的黏附行为。

拔牙窝在没有外界干预时正常愈合的第3 天，成纤维细胞便会迁移到拔牙窝的血凝块中形成肉芽组织，2 周时新生的肉芽组织便可充满整个拔牙窝[11]。软组织的入侵导致新骨无法生成，因此GBR 屏障膜需要在骨缺损修复早期能够有效阻挡成纤维细胞进入骨缺损区，为新骨生成创造相对封闭的环境。在本研究中，将成纤维细胞接种在膜片的光滑面时，细胞仅沿着光滑面表面生长，未进入膜内部，这是由于膜片光滑面纤维排列整齐且致密，纤维之间的空隙尺寸小于细胞尺寸，细胞被阻挡不能进入膜内部；而将成纤维细胞接种在粗糙面后，由于纤维间空隙尺寸较大，细胞会沿着交错疏松的纤维孔隙向膜内迁移。此结果与马超[10]等的研究结果一致。对比表明，胶原膜的光滑面对成纤维细胞能够起到良好的屏障作用，同时，实验结果也表明了成纤维细胞能够在胶原膜光滑面良好附着并增殖。

GBR 的最终目的是促进骨细胞的生长，并最终形成骨质，因此屏障膜能够促进成骨细胞的黏附也很重要。成骨细胞属于贴壁细胞，黏附后才可迁移、增殖和分化，而细胞形态可反映细胞黏附的状况，扁平的细胞可通过胞浆突起和片状伪足牢固地黏附[10]。本研究清晰地观察到，成骨细胞在胶原膜的粗糙面表现出良好的生长状况，细胞质充足，细胞骨架充分铺展，细胞扁平呈星型，伸出片状伪足，紧密黏附于材料表面，表明成骨细胞能够在胶原膜的粗糙面进行良好黏附。