负载分子信标的生物矿化纳米载体用于检测microRNA

吴玉婷，王彩霞†，刘志洪，2†

1. 湖北大学化学化工学院/有机化工新材料湖北省协同创新中心/有机功能分子合成与应用教育部重点实验室，湖北 武汉430062；2. 武汉大学 化学与分子科学学院，湖北 武汉430072

0 引 言

微小核糖核酸microRNA（简称miRNA）是一类长度为19～23 个核苷酸的短单链非编码RNA，其异常表达与肿瘤的发生和发展密切相关，因此miRNA 作为肿瘤标志物和治疗靶点的研究受到了广泛关注[1,2]。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）是基因检测中最常用的miRNA 检测方法，但由于设备昂贵、检测过程复杂，只能用于体外检测，不能满足在活细胞中检测miRNA 的需求。分子信标（molecular beacon，MB）作为最常用的核酸探针具有高生物相容性和高选择性，且易于合成、可设计性强，在基因检测方面表现出很大优势[3～5]。MB 是一类具有茎环（stem-loop）发夹结构的单链核酸分子，识别序列位于环路区域，其茎区域荧光团的荧光易被附近的猝灭基团猝灭[4]；当遇到特定RNA时，MB 的发夹结构与其形成稳定的杂化双链而打开，可使荧光恢复[6，7]。因此，可以利用体系中MB荧光信号的变化来检测目标RNA。但通常情况下，游离的MB 不易被活细胞摄取，而易被细胞内的核酸酶降解，导致假阳性信号的产生，从而影响MB 的检测效果[8]。为了实现活细胞内高灵敏度检测miRNA，迫切需要设计一种能将MB 高效递送至细胞内的纳米载体。用于递送MB 的无机纳米载体主要有金属及其化合物[9，10]、金属-有机框架[11]、碳基材料[12]等。但这些材料存在难以降解的问题，可能导致生物毒性。使用不同的生物模板（如蛋白质和多肽）修饰无机物，可以得到生物矿化纳米载体，制备方法简单、降解性能好，且易于修饰，具有广阔的临床应用前景[13,14]。磷酸钙、碳酸钙、硅酸钙等是生物硬组织的主要无机成分，可以在酸性环境下降解成无毒的离子，参与生命体的正常代谢。因此，基于磷酸钙、碳酸钙、硅酸钙等的生物矿化纳米材料具有良好的生物相容性和降解性能，可用于递送蛋白质、多肽和药物，广泛用于疾病的诊断与治疗[15～18]。

牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）作为一种生物矿化相关蛋白，其分子中的酸性残基可以螯合过饱和亚稳态溶液中的Ca2+形成成核位点，不断浓缩Ca2+以增加局部过饱和度，随后在磷酸盐参与下，自发形成磷酸钙（CaP）[19，20]。基于以上研究，本文以白蛋白为生物模板，表面矿化磷酸钙，得到一种生物矿化纳米载体BSA/CaP，再通过Ca2+与MB 的静电相互作用负载MB，得到纳米探针MB@BSA/CaP，并将其用于检测肿瘤细胞中过表达的标志物miRNA-155。

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

仪 器：RF-6000 型 荧 光 光 谱 仪（Shimadzu 公司），Nicolet iS10 型Fourier 转换红外光谱仪（FTIR，Thermo Scientific 公司），JEM-2100 型透射电子显微镜（TEM，JEOL 公司），ZS90 型纳米粒度电位仪（DLS，马尔文公司），LSM-880 型多光子共聚焦荧光显微镜（CLSM，Zeiss 公司）。

试剂：氯化钙、BSA 均为国产分析纯试剂；噻唑蓝（MTT）、细胞核染色剂（Hoechst 33342）均为国产生化纯试剂；脱氧核糖核酸酶（DNase Ⅰ）购自宝生物工程（大连）有限公司；Dulbecco 改良培养基（DMEM）和商用脂质体载体（Lipofectamine 2000）均来自赛默飞世尔科技公司；DNA 寡核苷酸和miRNA 购于上海生工生物工程公司，详细序列见表1；实验用水均为超纯水。

表1 DNA 寡核苷酸和miRNA 序列Table 1 Sequences of DNA oligonucleotide and miRNA

1.2 合成方法

1.2.1 BSA/CaP 纳米载体的合成

根据文献方法[19]制备纳米载体。将10 mg BSA加入到1 mL DMEM（含有0.9 mmol/L PO43-）培养基中，用封口胶密封，在37 ℃培养箱中静置孵育24 h后，加入10 μL CaCl2（1 mol/L）溶液，继续孵育24 h，13 300 r/min 离心15 min，用超纯水清洗干净，得到BSA/CaP 纳米载体。将BSA/CaP 在超纯水中分散，配制1 mg/mL 分散液，于-20 ℃保存备用。

1.2.2 MB@BSA/CaP 纳米探针的合成

将10 mg BSA 加入到1 mL DMEM 培养基中，用封口胶密封，在37 ℃培养箱中静置孵育24 h。将10 μL CaCl2（1 mol/L）分别与不同浓度的MB 分散液（100～400 nmol/L）混合，振荡2 h，加入到上述体系中，继续孵育24 h，13 300 r/min 离心15 min，用超纯水清洗干净，得到MB@BSA/CaP 纳米探针。将MB@BSA/CaP 在超纯水中分散，配制1 mg/mL 分散液，于-20 ℃保存备用。

另外，将商用脂质体载体Lipofectamine 2000（1 mg/mL, 2 μL）与MB 分散液（100 μmol/L,1 μL）混合，加 入100 μL 培 养 基，静 置20 min，得 到Lipofectamine 2000/MB，用作细胞实验的对照组。

1.3 检测方法

测试MB 的选择性。将100 nmol/L 的miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-21、miRNA-221、miRNAlet 7a、miRNA-155 与100 nmol/L 的MB 在pH 为7.40 的Tris-HCl 杂 交 缓 冲 溶 液（含1 mmol/L 的MgCl2和100 mmol/L 的KCl）中 共 孵 育40 min，用荧光光谱仪测试体系的荧光光谱，考察MB 的选择性。 此MB 的荧光基团是FAM，猝灭基团是BHQ1。

使用仅修饰荧光团FAM 的MB-FAM 测试在BSA/CaP 纳米载体中的负载量。将10 μL 1 mol/L CaCl2溶 液 分 别 与 不 同 浓 度（100、200、300、400 nmol/L）的MB-FAM 混合，振荡2 h。样品用超纯水多次离心、洗涤，除去未负载的MB-FAM。根据MB-FAM 荧光标准曲线，计算负载量和包封率。

测试纳米载体的保护性能。将不同MB 负载量的MB@BSA/CaP 纳米探针在超纯水中分散，使MB 的终浓度均为100 nmol/L。在MB 分散液和不同MB 负载量的MB@BSA/CaP 分散液中分别加入10 μL 的100 U/mL DNase Ⅰ，于摇床中37 ℃振荡30 min，测试体系的荧光光谱。同时检测相同条件下不加DNase Ⅰ的体系的荧光光谱。此实验中使用的MB 荧光基团是FAM，猝灭基团是BHQ1。

1.4 细胞内检测miRNA-155

人源乳腺癌细胞（MCF-7 细胞）和鼠源脑微血管内皮细胞（bEnd.3 细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司）的培养：将细胞置于含10%胎牛血清、1%抗生素（100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 链霉素）的DMEM 培养基中，于37 ℃、5% CO2的湿润环境中培养。

为了检测细胞内miRNA-155，首先将MCF-7细胞（或bEnd.3 细胞）接种于35 mm 玻璃底培养皿中，每皿的接种密度为1×105个细胞，于培养箱中37 ℃孵育24 h，移去培养基，再加入含有Lipofectamine 2000/MB 或MB@BSA/CaP 的新鲜培养基，MB 的终浓度为100 nmol/L，再次孵育6 h，用磷酸盐缓冲溶液（PBS）清洗3 次，加入细胞核染色剂Hoechst 33342（终浓度7.5 μg/mL）与细胞共培养10 min，标记细胞核，最后用共聚焦荧光显微镜进行细胞成像分析。此实验中使用的MB 荧光基团是Cy5，猝灭基团是BHQ2。

2 结果与讨论

2.1 BSA/CaP 纳米载体的表征

本文制备了BSA/CaP 纳米载体，并通过多种测试手段对其表征，如图1 和图2(a)～(d)所示。从CaP、BSA 和BSA/CaP 的FT-IR 图（图1）可以看出，BSA/CaP 的谱中同时观察到BSA 的C=O 振动特征峰（1 643 cm-1）和CaP 的P—O 振动特征峰（1 036 cm-1），证明BSA/CaP 纳米载体成功合成。从BSA/CaP 的TEM 图（图2(a)）可以看出，BSA/CaP 纳米载体为中空球型结构，平均尺寸约60 nm；BSA/CaP 的DLS 图（图2(b)）显示，BSA/CaP 的水合粒径为118 nm，分散系数（PDI）为0.119，具有良好的分散性；BSA/CaP 的Zeta 电位图（图2(c)）显示，BSA/CaP 表面带负电荷，其表面电位与BSA 的电势接近。将BSA/CaP 负载带正电荷的荧光染料Cy7，分别加入到pH 5.00 和pH 7.40 的缓冲溶液中，考察了体系的荧光强度变化。如图2(d)所示，在中性环境中（pH 7.40），体系荧光强度（激发波长λex=750 nm，发射波长λem=796 nm）较弱，说明有少量的Cy7 从载体中释放；而当pH 值为5.00 时，体系荧光信号显著增强，表明有大量Cy7 从载体中释放。这是由于BSA/CaP 纳米载体中的CaP 在酸性环境下水解生成了钙离子和磷酸根离子[15]，使载体不稳定，导致大量Cy7 的释放。 纳米载体的酸响应性能有助于其在细胞溶酶体酸性环境（pH 5.00）中快速释放负载的MB，并在钙离子作用下促进MB 从溶酶体中逃逸，与细胞质中miRNA-155 反应，避免MB 在溶酶体中长时间滞留而被酶降解，从而提高探针检测miRNA-155 的灵敏度。

图1 CaP、BSA 和BSA/CaP 的FT-IR 图Fig.1 FT-IR spectra of CaP, BSA and BSA/CaP

图2 BSA/CaP 的TEM 图（a）、DLS 图（b）、Zeta 电位图（c）；(d)不同pH 值条件下BSA/CaP 释放Cy7 的荧光强度变化曲线Fig.2 TEM (a), DLS (b), Zeta potential(c)images of BSA/CaP;(d)the change curves of fluorescence intensity of Cy7 released from BSA/CaP at different pH conditions

2.2 MB@BSA/CaP 纳米探针的表征

对MB@BSA/CaP 纳米探针进行表征，结果如图3(a)～(c)所示。在构建MB@BSA/CaP 纳米探针之前，首先考察了MB 对miRNA-155 的选择性。此MB 的荧光基团是FAM，猝灭基团是BHQ1。如图3(a)所示，MB 与miRNA-155 共孵育40 min 后，体系的荧光强度（λex=490 nm，λem=523 nm）显著增强，增强倍数（F/F0）为25，而与miRNA-10b、miRNA-27a、miRNA-21、miRNA-221 和miRNA-let 7a 等非目标miRNA 几乎不发生反应，表明MB 对miRNA-155 表现出良好的响应能力和选择性。

图3 （a）MB 对miRNA155 的选择性；（b）MB-FAM 荧光强度与浓度的线性关系；（c）BSA/CaP 对MB-FAM 的负载量和包封率Fig.3 (a)MB’s selectivity toward miRNA155;(b)linear relationship between MB-FAM fluorescence intensity and concentrations;(c)the loading capacity and encapsulation efficiency of MB-FAM in the BSA/CaP

将仅修饰荧光基团FAM 的MB-FAM 负载到BSA/CaP 纳米载体中，考察体系荧光强度（λem=523 nm）的变化，并根据体系荧光强度随浓度变化的标准曲线（图3(b)），计算负载量和包封率，结果如图3(c)所示。在BSA/CaP 纳米载体中加入400 nmol/L MB-FAM 时，MB-FAM的负载量为331.24 nmol/L，包封率为82.81%，表明BSA/CaP纳米载体可高效负载MB-FAM。

研究了不同MB 负载量对MB@BSA/CaP 纳米探针的粒径和形貌的影响。如图4 所示，不同MB负载量的纳米探针形貌相似，均为中空球型结构，且随着加入MB 浓度的逐渐增加，纳米探针的粒径由（57.7±3.3）nm 增加至（78.1±4.0）nm。进一步通过DLS 测得MB@BSA/CaP 纳米探针的水合粒径也是随着MB 负载量的增加而增大（表2），但其PDI 值始终在0.200 左右，表明纳米探针具有良好的分散性。

图4 不同MB 负载量的MB@BSA/CaP 的TEM 图和相应的粒径分布图（插图）Fig.4 TEM images and corresponding particle size distributions images (illustration)of MB@BSA/CaP loaded with different amounts of MB

表2 不同MB 负载量MB@BSA/CaP 纳米探针的水合粒径和PDITable 2 Hydrodynamic size and PDI of MB@BSA/CaP nanoprobes loaded with different amounts of MB

2.3 MB@BSA/CaP纳米探针的抗DNase Ⅰ降解性能

研究了游离MB 和不同MB 负载量MB@BSA/CaP 纳米探针抗DNase Ⅰ（1 U/mL）降解的性能，结果如图5(a)所示。游离的MB 与DNase Ⅰ共孵育后荧光显著增强，是由于游离MB 容易在DNase Ⅰ作用下被降解，荧光基团和猝灭基团之间距离增大，荧光共振能量转移（FRET）作用消失，从而使荧光信号恢复。相比之下，不同MB 负载量MB@BSA/CaP纳米探针与DNase Ⅰ共孵育，荧光强度发生了不同程度的增强。当MB 的加入量为100 nmol/L 或200 nmol/L 时，纳米探针的荧光信号仅有微弱增强，表明纳米载体可以有效阻止MB 被DNase Ⅰ降解。当MB 的加入量为300 nmol/L 或400 nmol/L 时，荧光信号增强明显，证明MB 部分被DNase Ⅰ降解，纳米载体的保护作用有所减弱。这是因为加入MB浓度过大时，MB 会吸附至纳米载体外表面，导致纳米载体的保护作用减弱。分别将游离的MB 和不同MB 负载量MB@BSA/CaP 纳米探针与目标物miRNA-155（100 nmol/L）在杂交缓冲溶液中共孵育（如图5(b)所示），可以发现，随着MB 负载量增加，纳米探针对miRNA-155 响应的荧光信号逐渐增强，也证明了纳米载体对MB 的保护作用逐渐减弱。因此，为了提高纳米探针在细胞内检测miRNA的准确性，避免产生假阳性信号，MB 的加入量应低于200 nmol/L。

图5 游离的MB 和不同MB 负载量MB@BSA/CaP 纳米探针与DNase Ⅰ反应后的荧光强度（a）以及与目标物miRNA-155 反应后荧光强度变化曲线（b）Fig.5 Fluorescence intensity for free MB and MB@BSA/CaP nanoprobe loaded with different amount of MB reacted with DNase Ⅰ(a);plot for the fluorescence intensity of probes reacted with the target miRNA-155 and time (b)

2.4 MB@BSA/CaP 纳米探针的细胞内荧光成像

将不同用量的MB@BSA/CaP 纳米探针与MCF-7 细胞共孵育24 h 后，通过MTT（噻唑蓝）法测定细胞存活率，考察了MB@BSA/CaP 纳米探针的细胞毒性。纳米探针的用量在10～400 μg/mL 范围内，细胞存活率均大于90%，表明纳米探针细胞毒性低，具有良好的生物安全性，适用于细胞成像。

研究了MB@BSA/CaP 纳米探针对MCF-7 细胞内miRNA-155 的荧光成像。此实验中使用的MB 荧光基团是Cy5，猝灭基团是BHQ2。将游离MB、MB@BSA/CaP 和Lipofectamine 2000/MB 分别加入到MCF-7 细胞中共孵育（MB 100 nmol/L），通过共聚焦荧光显微镜观察成像效果，结果见图6。如图6(a)所示，MCF-7 细胞与游离MB 共孵育几乎无明显荧光，这是因为游离MB 很难穿透细胞膜而被细胞摄取，导致成像效果差。将商用脂质体载体Lipofectamine 2000 负 载 MB 制 备 探 针 Lipofectamine 2000/MB，加入到MCF-7 细胞中，观察到较明显的红色荧光。而在MCF-7 细胞中加入MB@BSA/CaP 纳米探针后观察到强烈红色荧光，是由于纳米探针被MCF-7 细胞摄取后，在胞内溶酶体酸性环境下释放MB 与miRNA-155 杂交，使MB 的发夹结构打开，荧光恢复。根据图6(b)，MB@BSA/CaP 组的细胞平均红色荧光强度是Lipofectamine 2000/MB 组细胞的5.07 倍。这也进一步证实MB@BSA/CaP 比Lipofectamine 2000 更容易被MCF-7 细胞摄取，能够将更多的MB 递送至细胞内与miRNA-155 反应，从而提高MB 检测细胞内miRNA 的灵敏度。

图6 （a）MCF-7 细胞与游离的MB（A）、Lipofectamine 2000/MB（B）和MB@BSA/CaP（C）共孵育后的CLSM 图像；（b）A-C 对应的平均红色荧光强度细胞核用Hoechst 33342 染色；成像条件：λex=643 nm，λem=650-754 nmFig.6 (a)CLSM images of MCF-7 cells incubated with free MB (A), Lipofectamine 2000/MB (B), and MB@BSA/CaP nanoprobe (C);(b)mean red fluorescence intensity in images A-C The cell nuclei were stained by Hoechst 33342;imaging condition：λex=643 nm, λem=650-754 nm

miRNA-155 可能与多种肿瘤的发生和发展有密切关系[21,22]。因此，进一步通过测定MB@BSA/CaP（MB 100 nmol/L）纳米探针在肿瘤细胞（MCF-7）和正常细胞（bEnd.3）中的荧光强度，评估不同细胞内miRNA-155 的表达。如图7 所示，与bEnd. 3细胞相比，MCF-7 细胞与MB@BSA/CaP 纳米探针共孵育后的体系显示出更强的荧光信号，其平均红色荧光强度是bEnd.3 细胞体系的8.10 倍。这是由于肿瘤细胞中表达了更多的miRNA-155 所致。结果表明，该纳米探针可对细胞内不同表达量的miRNA-155 进行可视化成像检测。

图7 （a）MB@BSA/CaP 纳米探针分别与bEnd.3 细胞和MCF-7 细胞孵育后的CLSM 图像；（b）(a)图的平均红色荧光强度细胞核用Hoechst 33342 染色；成像条件：λex=643 nm，λem=650-754 nmFig.7 (a)CLSM images of MB@BSA/CaP nanoprobe incubated with bEnd.3 cells and MCF-7 cells respectively;(b)mean red fluorescence intensity in image (a)The cell nuclei were stained by Hoechst 33342;imaging condition：λex=643 nm, λem=650-754 nm

3 结 语

本文利用生物矿化法构建了一种酸响应的生物矿化纳米载体BSA/CaP，通过静电相互作用高效负载MB，制备了MB@BSA/CaP 纳米探针。该纳米探针制备方法简单、分散性良好，为中空球型结构，MB 负载量高（331.24 nmol/L），其粒径随着MB负载量的增加而增大，且细胞毒性低，可被肿瘤细胞高效摄取,并可用于胞内miRNA-155 可视化成像检测。另外，该纳米载体可保护MB 不被DNaseⅠ降解，从而减少假阳性信号的产生，提高了探针检测的准确性。本工作为肿瘤标志物的检测提供了一种新颖可靠的方法，有望在复杂的生理环境中识别肿瘤细胞。