Na2SeO3-SA/CS微球/α-CPC基复合骨水泥的制备与性能

李香香, 冉 青, 毛 敏, 辛国鹏, 刘信平

(湖北民族大学 化学与环境工程学院,湖北 恩施 445000)

近年来,研发促修复、抗菌抗肿瘤的功能性骨修复材料是人工植骨临床应用关注的热点。自固化可注射的磷酸钙骨水泥(CPC)以其良好的生物相容性、骨诱导性成为应用潜力巨大的植骨材料。但随着临床应用的深入,这类材料存在降解速度较自体骨生长慢而使新骨生长受限、机械强度较差、水化时的放热促使周围机体组织炎症、无术后抗肿瘤复发能力等严重缺陷[1-2]。为改善CPC材料的不足性能,学者们进行了大量的改性研究。通过向材料中掺入药物如强力霉素、多巴胺、头孢等[3-5],发挥靶向药物的抗炎症、防止癌细胞复发和转移的功能。通过添加微量元素(如Sr2+、 Mg2+和 Zn2+)、丝素蛋白和壳聚糖等易降解促新骨生长的聚合物、纤维以及石墨烯等功能性物质[6-8],改善其力学强度、骨修复性能。

20世纪随着人们对元素硒广泛生物学活性功能认识的深入,近年来有研究证实,硒与骨骼健康密切相关[9-10]。含硒骨材料不仅能抗菌抗肿瘤、促新骨生长[11-12],还能降低一些药物(如抗生素、顺铂)对骨骼的侵害,保护骨骼[13-14]。Wang等[15]合成了3D多孔层状SeHAN/CS复合材料,动物实验显示表明,缺损骨处新骨组织血管的形成优于HAN/CS材料,更优于纯HA。硒涂层于植骨材料表面的细胞实验表明,硒含量适当时能促成骨细胞形成,防止细菌感染,抑制肿瘤细胞的复发和增殖[16]。据文献报道,将含硒材料与正常成骨细胞和骨肿瘤细胞共同培养时,材料能促进正常细胞增殖,同时又表现出对骨肿瘤细胞增殖的抑制作用[17]。

含硒骨材料在骨肿瘤术后抗感染、预防肿瘤细胞转移和复发方面具有良好应用前景。硒化物中抑癌作用最强的是无机形态Na2SeO3,因此,可通过不同机制诱导肺癌、胃癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞的凋亡,能有效清除氧自由基的侵害,对放化疗有保护作用[18]。目前,含硒骨材料的研究尚处于初级阶段。与人体其它功能性元素一样,硒作为一把双刃剑[19-20],适量有益,偏低效果差、超量而引发硒中毒,控量成为硒广泛应用的瓶颈,因此,硒如何缓慢、长时地释放有效作用浓度成为筮待解决的关键问题。以壳聚糖(CS)、明胶等高分子聚合物为壁材制备的载药缓释胶囊实现了药物控剂的靶向疗法,以其安全稳定性成为临床应用的主导趋势[21-22]。本研究结合CS和海藻酸钠(SA)优良的载药性能及利于机体修复、硒元素的抑菌抗癌等生物活性功能,制备Na2SeO3-SA/CS缓释硒微球,并将一定量微球掺入α-CPC中制得Na2SeO3-SA/CS微球/α-TCP基复合骨水泥,并对复合材料的结构和基本性能进行表征和测试,考察了其对MG63细胞增殖的抑制性能,以期使功能性硒元素在骨修复时能长时间持续缓慢地释放有效作用浓度,改善CPC的降解性、强度、骨修复性能,为临床上术后所需的促进新骨形成、防止肿瘤复发和转移以及抗炎症的优良植骨材料的选择提供一种新思路,同时奠定必要的实验基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Nicolet Avatar 370型红外光谱分析仪(KBr压片);SHIMADZU XRD-7000型射线衍射仪;PerkinElmer DE-6300型综合热分析仪;Malvern Nano-ZS型马尔文激光电位粒度仪。

肉骨瘤MG63细胞、壳聚糖(CS,脱乙酰度>90%)、海藻酸钠(SA)、亚硒酸钠、硝酸钙、磷酸氢钙(DCPD)、柠檬酸、碳酸钙。试剂均为AR或GR。

1.2 Na2SeO3-SA/CS微球制备

A液制备：1.00 g Na2SeO3溶于100.00 mL去离子水,再加入0.10 g海藻酸钠(SA),搅拌至充分溶解,待用。

B液制备：磁力搅拌下,将1.00 g壳聚糖(CS)溶于100.00 mL 2%醋酸液中。

Na2SeO3-SA/CS微球制备：将盛有50.00 mL石蜡油(5% Span80)的烧杯置于65 ℃的恒温水浴锅中。在持续磁力搅拌环境下,用注射器吸取10.00 mL A液以2 mL/min的滴速加到油相中,待A液滴加完全,继续搅拌30 min。用注射器以2.00 mL/min的滴速将10.00 mL B液缓慢加入反应液中,滴加完毕后搅拌30 min,再缓慢滴加0.50 mL 12.5%的戊二醛交联1 h,加入10.00 mL丙酮静置10 min，破乳,离心得沉淀物。分别用无水乙醚和无水乙醇洗涤产物至滤液澄清,并将滤饼于40 ℃干燥箱烘干制得Na2SeO3-SA/CS微球。

样品微波消解,用AFS-9760双道原子荧光仪测其中硒含量,设定载气流量为300 mL/min,屏蔽气流量为800 mL/min,辅阴极灯电流为35 mA。样品平行测定3次,由公式(1)、 (2)计算微球的包封率和载药量：

包封率=M微球中硒质量/M投入硒质量×100%

(1)

载药量=M微球中硒质量/M微球质量×100%

(2)

1.3 Na2SeO3-SA/CS/α-CPC的制备

α-TCP制备：配制0.15 mol/L Ca(NO3)2·4H2O、 0.10 mol/L (NH4)2HPO4溶液各1 L。在磁力搅拌下,将Ca(NO3)2·4H2O溶液逐滴加入到(NH4)2HPO4溶液中,加入完毕,氨水调pH=7左右。继续搅拌4 h，将其置于37 ℃水浴锅中陈化1 d,抽滤，先后用去离子水和无水乙醇洗涤,并于80 ℃烘箱烘干,转移产品至坩埚并在马弗炉中高温煅烧,升温程序以6 ℃/min的速度先升至1000 ℃,再以4 ℃/min的速率升到1300 ℃,并在此温度下保持2 h后迅速取出急冷,干燥环境中保存产品备用。

α-CPC制备：为增强α-TCP的抗压强度,常需添加增强剂制得CPC,以此改善材料的不足[23]。本实验将制得的α-TCP用无水乙醇湿法球磨一定时间后,将其与球磨过筛后的DCPD和CaCO3粉末按照摩尔物质的量比为10.0 ∶0.5 ∶0.5混均磨匀制得α-CPC粉体。

Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥的制备：称取一定量Na2SeO3-SA/CS微球,加入到α-CPC粉体中混均,加入固化液快速调和成牙膏状、填入模具(φ=10 mm×10 mm)、加压排气泡、脱模得圆柱体试样。将试样于37 ℃、 95%相对湿度环境中干燥1 d,制得的Na2SeO3-SA/CS/α-CPC基复合骨水泥。

1.4 体外细胞活性试验

采用CCK-8法[24-25]测定Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥对肉骨瘤MG63细胞增殖的抑制作用。

待测样液：将复合骨水泥材料浸泡于37 ℃ SBF模拟液中,缓释液缓释时间分别为0.5、 1、 5、 10和50 h,采用0.2 μm微孔的滤膜过滤除菌。对数生长期的肉骨瘤MG63细胞,经2.5 mg·mL-1胰蛋白酶消化制成细胞悬液,采用细胞计数板计数,将细胞浓度调至4.375×104个/mL,并以每孔200 μL接种于96孔板里,培养箱中培养24 h。待取出后,吸去培养液,取缓释不同时间段的200 μL样液加到96孔板中,各试样均设复孔3个,将孔板置于培养箱中分别培养24、 48和72 h,每孔加入CCK-8试剂20 μL,继续在培养箱中孵育40 min。取出后，采用酶标仪测其吸光度,各试样对人骨肉瘤MG-63生长的抑制率由公式(3)计算：

抑制率=[(Ab-Aa)/(Ab-Ac)]×100%

(3)

式中Aa为实验孔吸光度,Ab为对照孔吸光度,Ac为空白孔吸光度。

2 结果与讨论

2.1 α-TCP球磨时间对α-CPC性能的影响

(1) 粒径的影响

采用Nano-ZS测量样品的粒径、球磨时间对α-TCP粒径的影响如图1所示。由图1可知,α-TCP粉体粒径随球磨时间的增长呈现先减小后增大的趋势。球磨时间为4 h时,粉体的平均粒径最小为116 nm,这可能是4 h前为球磨初期,粉体间、球磨球间、球磨球与粉体间、磨球罐壁间的快速碰撞,粉体迅速分裂、破损致使α-TCP粉体的粒径减小至116 nm,此时微纳级别的α-TCP颗粒间接触面积大,表面能较大,若继续球磨,反而促使α-TCP颗粒间随着碰撞重新焊合,导致部分颗粒粗化,使得α-TCP粉体的粒度又逐渐增大。

Time/h图1 α-TCP球磨时间对其粒径的影响Figure 1 Effect of α-TCP ball milling time on its particle size

(2) 固化时间的影响

球磨时间对α-CPC初凝(IT)和终凝(FT)时间的影响如图2所示。由图2可知,不同球磨时间的α-TCP基粉体制得的α-CPC骨水泥的IT和FT固化时间顺序为：4 h<1 h<8 h<12 h<16 h。

Time/h图2 α-TCP球磨时间对α-CPC固化时间的影响Figure 2 Effect of α-TCP ball milling time on α-CPC solidification time

球磨4 h时的固化时间最短(IT=6.9 min, FT=13.9 min),这是粉体粒径与其溶解度呈负相关性,颗粒粒径越小,比表面越大,溶解速率越快,使得α-CPC浆体过饱和度提升,促使快速凝固。

α-TCP基粉体球磨时间对α-CPC抗溃散能力(浸泡12 h)的影响如图3所示。由图3可知,球磨16 h的α-CPC试样中间断裂且有大小不均的碎渣掉落。球磨12 h和8 h的试样外层部分脱落、四周散落较多,大小不一且试样为碎渣。球磨1 h的试样碎渣掉落相对减少,球磨4 h的试样脱落情况最为轻微。浸泡液浑浊程度顺序为4 h<1 h<8 h<12 h<16 h。实验证明,α-TCP基粉体粒径是影响骨水泥抗溃散能力的重要因素,与粉体基粒径呈负相关,粒径越小,骨水泥固化时结合越紧密,能有效阻止模拟体液渗入材料内部,防止断裂,提高α-CPC的抗溃散能力。

图3 α-TCP球磨时间对α-CPC抗溃散性能的影响Figure 3 Effect of α-TCP ball Milling time on α-CPC battering resistance

Time/d图4 骨水泥在SBF中浸泡pH变化曲线Figure 4 pH change curves of bone cement soaked in SBF

(3) 降解能力的影响

球磨时间对α-CPC降解能力的影响如图4和图5所示。由图4可知,由不同球磨时间的α-TCP粉体制得的骨水泥在降解过程中,其浸泡液pH变化曲线形状相似,均为先降低后略微上升,即第1～3 d从pH=7.4降到6.5～6.7之间,而第3～5 d试液的pH基本平稳，这是由于在降解初期,骨水泥中的柠檬酸迅速扩散到浸泡液中,使其pH迅速下降呈弱酸性。而第5 d后,pH开始小幅度上升,这是由于骨水泥的水化反应生成了羟基磷灰石,促使浸泡液的pH缓慢上升。图5的降解速率曲线显示：α-TCP粉体基球磨4 h制备的α-CPC降解速率最大,球磨16 h的降解速率最小,说明粉体粒径越小,α-CPC在模拟体液表面开始膨胀,材料溶解时与浸泡液接触面积增大,材料内部产生的应力越大,促使材料本身沿晶面分散致其内部产生微裂缝,故其降解速率越快。

Time/d图5 骨水泥在SBF中浸泡的降解速率Figure 5 Degradation rate of bone cement soaked in SBF

2.2 载硒微球掺入量对复合骨水泥性能影响

以球磨4 h的α-CPC掺入质量分数1%、 3%、5%和7%的Na2SeO3-SA/CS微球时所得复合骨水泥的相关性能如表1所示。从表1可以看出,与纯α-CPC相比,载硒微球的加入能提升复合骨水泥的抗压能力和降解速率,且与微球的加入量呈正相关性。从固化时间来看,当掺入微球量小于7%时,固化时间比纯α-CPC(IT=6.9 min, FT=13.9 min)缩短,而超过7%时却有所延长(IT=7.0 min, FT=14.3 min)。微球掺入量在低于5%时,复合骨水泥的注射性和抗溃散性能优良。此外,从表1还可以看出,与纯α-CPC相比,载硒微球的加入能提升复合骨水泥的抗压能力和降解速率,且与微球的加入量呈正相关性。从固化时间来看,当掺入微球量小于7%时,固化时间比纯α-CPC(IT=6.9 min, FT=13.9 min)缩短,而超过7%时却有所延长(IT=7.0 min, FT=14.3 min)。微球掺入量在5%以下时,复合骨水泥的注射性和抗溃散性能优良。因此,经综合考虑,本文采用质量分数为5%载硒微球掺入量。

表1 Na2SeO3/CS微球掺入量对复合骨水泥性能的影响Table 1 Influence of the content of Na2SeO3/CS microspheres on the properties of composite bone cement

2.3 复合调和液组分含量、固液比对Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥固化性能的影响

后续实验均选取球磨4 h的α-TCP作为粉体基。壳聚糖具有良好生物相容性和可降解性,而柠檬酸促凝性优良,因此,本实验以二者混合物作为复合固化液制备Na2SeO3-SA/CS/α-CPC骨水泥。以壳聚糖浓度、柠檬酸浓度、固液比为变量设计L9(33)的正交试验,实验结果如表2所示。获得的数据用SPSS23.0统计软件进行方差分析,其结果如表3和表4所示。

表2 正交试验设计L9(33)Table 2 Orthogonal test design L9(33)

表3 初凝时间正交试验方差分析Table 3 Analysis of variance of orthogonal test of initial setting time

表4 终凝时间正交试验方差分析Table 4 Analysis of variance of orthogonal test for final setting time

由表1～3可知,3因素对复合骨水泥IT和FT的影响顺序为：固液比>SA>CS,相对于CS和SA,固液比对复合骨水泥的IT(P=0.034)和TF(P=0.018)的影响更为显著(0.050

2.4 复合骨水泥性能

(1) 形貌表征

Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥缓释前后的SEM照片如图6所示。从图6a和6d可以看出,纯α-CPC降解后表面形成了一些较小间隙和空腔,可在一定程度上支持生长细胞的黏附。图6b～c中圆滑的Na2SeO3-SA/CS微球被α-CPC均相包裹,形成了很好的Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥。Na2SeO3-SA/CS微球缓释前(图6b)后(图6e)由光滑的圆球转变为纵横交错的皱褶圆形,硒缓释效应显著。从图6f可知,复合骨水泥缓释后形成了完善的三维蜂窝状多孔结构,这主要是由微球中粒子的溶出缓释而形成的,同时这种特异微纳的降解结构,对细胞黏附生长、血管和神经长入、细胞外基质沉积矿化、营养和氧气的运输等提供了有利因素。因此，Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥具有良好的细胞生物学效应和成骨活性。

图6 材料缓释前后的SEM照片：α-CPC缓释前(a)、缓释后(d);Na2SeO3-SA-CS微球缓释前(b)、缓释后(e); Na2SeO3-SA-CS/α-CPC缓释前(c)、缓释后(f)Figure 6 SEM images of material:before sustained release(a) and after sustained release(d) of α-CPC; Before sustained release(b) and after sustained release(e) of microspheres of Na2SeO3-SA-CS; Before sustained release(c) and after sustained release(f) of Na2SeO3-SA-CS/α-CPC bone cement

(2)Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥的XRD和IR表征

复合骨水泥试样降解前后的XRD谱图如图7所示。由图7可知,与标准卡片比对,纯α-CPC、 Na2SeO3/α-CPC和 Na2SeO3-SA/CS/α-CPC 3种试样降解前后在21°、 29.3°、 30°和34°处出现α-TCP的衍射峰,而在18.1°、 24.3°和41.7°处出现较弱的β-TCP的衍射峰,这可能是高温烧制的α-TCP在取出急冷却时有少量α-TCP相转变为β-TCP。此外,该结果与IR谱图结论一致,且各试样降解后的峰强度较小,说明降解后试样中的α-TCP和β-TCP含量减少,转变成了HA。3种试样降解后,在11.7°、 22.9°和34.6°等处HA的衍射峰明显强于降解前的HA衍射峰,进一步证实α-CPC降解后的主要产物为HA。

2θ/(°)图7 复合α-CPC降解前后的XRD谱图Figure 7 XRD of composite α-CPC before and after degradation

复合骨水泥的IR谱图如图8所示。由图8可知,1584 cm-1和1500 cm-1处的吸收峰为CO32-的伸缩振动吸收峰。α-TCP的PO43-在1023 cm-1附近出现P—O的不对称伸缩振动特征峰,在551 cm-1处为PO43-的弯曲振动峰。1179 cm-1附近微弱的吸收峰为β-TCP中PO43-的伸缩振动吸收峰,从而表明α-TCP中有少量的β-TCP。

ν/cm-1图8 Na2SeO3-SA/CS/α-CPC的红外谱图Figure 8 Infrared spectra of Na2SeO3-SA/CS/α-CPC

(3) 热性能测定

复合α-CPC降解前后的DTG和DSC曲线如图9所示。由图9可知,各试样降解前后均出现了2个明显的失重阶段,第一阶段为温度240 ℃范围的失重,主要为分子内外的水,DSC曲线上的热效应变化不明显。第二阶段为温度800 ℃范围的失重,这主要是SA和CS的初步分解以及HA的分解。从DSC曲线可知,该阶段吸热现象显著,且各试样降解后所吸收的热量均大于降解前,这是由于降解后生成了大量HA物质。

Tempereture/℃

(4) 复合骨水泥体外缓释硒

Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥在SBF溶液中的缓释效果如图10所示。由图10可知,各试样在初期的8 h内,呈现突释特征,Na2SeO3-SA/CS微球、Na2SeO3/α-CPC和Na2SeO3-SA/CS/α-CPC中硒的累积释放率分别为60.57%、 45.00%和21.53%,这是附着在材料表面的硒快速扩散所致。8～120 h区间为缓慢释硒阶段,曲线缓慢上升,Na2SeO3-SA/CS微球、Na2SeO3/α-CPC和Na2SeO3-SA/CS/α-CPC中硒的累积释放率达77.71%、 53.04%和25.53%,说明微球溶胀增加,空隙深入微球内壁,包裹在微球内芯的药物释放出来,同时α-CPC水化反应生成的HA不断在表面沉积,使得硒的释放减缓。120 h以后释硒进入缓慢稳定阶段,1000 h时Na2SeO3-SA-CS微球、Na2SeO3/α-CPC和Na2SeO3-SA/CS/α-CPC的硒累积释放率分别为78.640%、 54.541%和32.340%。由于长时间浸泡,水化产物HA累积增多,附着在骨水泥降解产生的孔隙之间形成牢固的多维立体网状结构,使SeO32-的扩散速率受到抑制,导致药物缓释速率与水化产物HA的量呈负相关性。

Time of cumulative release/h图10 载硒α-CPC体外缓释曲线Figure 10 Selenium-containing α-CPC sustained release curve in vitr

2.5 复合骨水泥细胞活性

以样品分别培养1 d和7 d的培养液作用于肉骨瘤MG63细胞,采用CCK-8法检测对细胞增殖的抑制作用,试验组采用0.1 mg/mL Na2SeO3、阳性对照的紫杉醇浓度为0.5 μg/mL,试验结果如表5所示。

表5 样品对MG63细胞活性影响Table 5 Effects of samples on MG63 cell viability

由表5可知,Na2SeO3、 Na2SeO3-SA/CS微球和Na2SeO3-SA/CS/α-CPC 3个试样对MG63细胞的增殖都有抑制作用,且与空白对照组差异显著,抑制能力顺序为纯Na2SeO3>载硒微球>载硒复合骨水泥,而α-CPC骨水泥没有抑制作用,说明Na2SeO3是抑制MG63细胞增殖的活性物质,且抑制能力与其含量呈正相关性。Na2SeO3抑制率虽弱于阳性对照的紫杉醇,但其水溶性和成本低均利于应用。复合骨水泥中的载硒成分,能较长时间留存其中,发挥促修复、抗炎等生理功能。

3 结论

基质粉体球磨时间是影响骨水泥基本性能的重要因素。粉体粒径大小顺序为4 h<1 h<8 h<12 h<16 h,固化时间与粉体粒径呈反比,球磨4 h时粉体的平均粒径最小(116 nm),固化时间最短的IT=6.9 min, FT=13.9 min,溃散轻微,且降解速率在各个时段均大于其它球磨时间的粉体所制得的CPC。Na2SeO3-SA/CS微球的掺入能提升复合骨水泥的抗压强度和降解速率,其固化时间略微缩短,当掺入量超过5%,复合骨水泥的注射性和抗溃散性较差,以质量分数5%的掺入量最合适。复合调和液由25%(g/mL) SA和0.5%(g/mL) CS组成,固液比为1.0 ∶0.6, Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥的IT ∶FT为5.6 ∶12.8,符合临床需求。降解前圆滑的Na2SeO3-SA/CS微球被α-CPC均相包裹,形成了很好的Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥,降解后形成了完善的三维蜂窝状多孔结构,Na2SeO3-SA/CS微球的添加促使复合骨水泥水化成HA。Na2SeO3-SA/CS/α-CPC复合骨水泥避免了硒的突释效应,使得硒能长时间保持并发挥其活性功能。硒对MG63细胞的增殖有显著的抑制作用,且抑制效能与其浓度呈正相关性。本研究以期为研究促修复、防止肿瘤细胞复发和转移的功能性植骨材料提供可行思路,为含硒骨材料在体内外细胞实验和临床上的应用奠定基础。