血清Galectin⁃9和PD⁃L1对慢性乙型肝炎肝脏炎症程度的诊断价值

贾梦山 刘加敏 杨艳霞

慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）是乙型肝炎病毒（HBV）感染引起的世界性传染病。我国是CHB 高发国家，据统计，我国每年死于CHB相关肝硬化、肝癌等疾病的人高达100 多万［1⁃2］。目前，评价肝脏病理状态仍是CHB 基础与临床研究的热点问题。肝脏炎症是CHB 发展至肝硬化、肝癌的病理基础［3］。因此，早期诊断CHB 肝脏炎症程度具有重要临床意义。CHB 病机主要是免疫反应介导的肝损伤，机体免疫水平与病情进展及预后密切相关［4］。半乳糖凝集素⁃9（Galectin⁃9）是T 细胞免疫球蛋白域粘蛋白域蛋白⁃3（Tim⁃3）配体，研究表明，Tim⁃3/Galectin⁃9 信号通路活化可抑制T 细胞活化及Th1 免疫［5］。相关研究已证实，Galectin⁃9 在多种自身免疫性疾病、炎性疾病、肿瘤等发生及进展过程中起到重要作用［6］。程序性死亡受体⁃配体1（Programmed death ligand⁃1，PD⁃L1）是程序性死亡受体⁃1（PD⁃1）主要配体，可负向调节免疫应答，近年来，其在CHB 患者免疫调节中的作用日益受到重视［7］。目前，关于血清Galectin⁃9、PD⁃L1 对CHB 肝脏炎症程度的诊断价值，临床研究较少。本研究对此展开探讨，旨在为临床提供数据支持。报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年1月至2021年7月周口市疾控中心专科病医院CHB 患者126 例为观察组，同期选取45 名健康体检者为对照组。观察组纳入标准：均符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》［8］中CHB 诊断标准；患者及家属知情同意。对照组纳入标准：病毒性肝炎抗体、肝肾功能、血常规、腹部彩超、肿瘤系列等体检均正常；入试者均知情同意。排除标准：曾接受干扰素⁃α 类、核苷（酸）类等药物治疗；其他病毒性肝炎；自身免疫性肝病；失代偿期肝硬化；恶性肿瘤；凝血功能障碍；妊娠或哺乳期女性。本研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 临床特征收集

包括年龄、性别、肝功能指标、HBV⁃DNA、肝脏炎症分级、纤维化分期［9］等。HBV⁃DNA 及肝功能指标［谷丙转氨酶（Aspar⁃tate transaminase，AST）、谷草转氨酶（Alanine aminotransferase，ALT）、总胆红素（Total bilirubin，TBil）、凝血酶原时间（Pro⁃thrombin time，PT）、白蛋白（Albumin，Alb）］采用罗氏全自动生化分析仪检测；炎症活动度分级（G）为0～4 级，轻度肝脏炎症（G0+G1），显著肝脏炎症（G2+G3+G4）；肝纤维化分期（S）为0～4 期，轻度肝纤维化（S0+S1），显著肝纤维化（S2+S3+S4）。观察组HBV⁃DNA 为（8.27±1.09）×103拷贝/mL；炎症分级：G0=23 例，G1=47 例，G2=34 例，G3=18 例，G4=4例；纤维化分期：S0=47 例，S1=40 例，S2=32 例，S3=5 例，S4=2 例。

1.2.2 血清Galectin⁃9、PD⁃L1 检测

采集空腹肘静脉血3 mL，离心（时间15 min，半径8 cm，转速3 500 r/min），取血清，采用酶联免疫吸附试验测定Galectin⁃9，上海纪宁生物制剂公司试剂盒；采用流式细胞仪检测PD⁃L1。

1.3 统计学处理

采用统计学软件SPSS 22.0 处理数据，计量资料以（）描述，t检验；计数资料用n（%）表示，χ2检验；影响因素采用Logistic 回归分析；采用Spearman、Pearson 分析相关性；诊断价值采用受试者工作特征（ROC）曲线，获取AUC、置信区间、敏感度、特异度，联合预测实施Logistic 二元回归拟合，返回预测概率logit（p），将其作为独立检验变量。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床特征及血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平

两组年龄、性别、肝功能指标（AST、ALT、TBil、PT、Alb）比较，差异无统计学意义（P>0.05）；观察组血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 两组临床特征及血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平［n（%），（±s）］Table 1 Clinical characteristics and serum levels of Galectin⁃9 and PD⁃L1 in the two groups［n（%），（±s）］

表1 两组临床特征及血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平［n（%），（±s）］Table 1 Clinical characteristics and serum levels of Galectin⁃9 and PD⁃L1 in the two groups［n（%），（±s）］

指标观察组（n=126）对照组（n=45）t/χ2值P 值年龄≥40 岁<40 岁性别58（46.03）68（53.97）21（46.67）24（53.33）0.005 0.942男女0.058 0.809肝功能指标AST（U/L）ALT（U/L）TBil（μmol/L）PT（s）Alb（g/L）HBV⁃DNA（×103拷贝/mL）Galectin⁃9（ng/mL）PD⁃L1（%）73（57.94）53（42.06）33.31±7.25 32.58±8.96 16.94±5.06 12.84±1.36 40.61±3.87 8.27±1.09 1.92±0.55 1.52±0.34 27（60.00）18（40.00）32.79±6.84 31.55±8.43 16.31±4.28 12.62±1.13 41.15±4.16 0.419 0.672 0.745 0.972 0.788 0.676 0.503 0.457 0.333 0.432 0.33±0.15 0.38±0.17 19.108 21.523<0.001<0.001

2.2 CHB 患者血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平与主要临床特征相关性

CHB 患者血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平与HBV⁃DNA、炎症分级、纤维化分期均呈正相关（P<0.05）。见表2。

表2 CHB 患者血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平与主要临床特征相关性Table 2 Correlations between serum Galectin⁃9 and PD⁃L1 levels and main clinical characteristics in CHB patients

2.3 CHB 患者显著肝脏炎症单因素分析

126 例CHB 患者中，轻度肝脏炎症（G0+G1）69 例，显著肝脏炎症（G2+G3+G4）57 例。HBV⁃DNA、Galectin⁃9、PD⁃L1 均为CHB 患者显著肝脏炎症相关因素（P<0.05）。见表3。

2.4 CHB 患者显著肝脏炎症多因素Logistic 回归分析

以CHB 患者肝脏炎症程度为因变量（赋值：轻度肝脏炎症=1，显著肝脏炎症=2），将表3中差异有统计学意义的项作为自变量（赋值：实际值），应用Logistic 回归模型分析，结果显示，HBV⁃DNA 及血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平升高均为CHB 患者显著肝脏炎症独立危险因素（P<0.05）。见表4。

表3 CHB 患者显著肝脏炎症单因素分析［n（%），）（±s）］Table 3 Univariate analysis of significant liver inflammation in CHB patients［n（%），）（±s）］

表3 CHB 患者显著肝脏炎症单因素分析［n（%），）（±s）］Table 3 Univariate analysis of significant liver inflammation in CHB patients［n（%），）（±s）］

指标年龄≥40 岁<40 岁性别轻度肝脏炎症（n=69）显著肝脏炎症（n=57）χ2/t 值P 值31（44.93）38（55.07）27（47.37）30（52.63）0.075 0.784男女39（56.52）30（43.48）34（59.65）23（40.35）0.125 0.723肝功能指标AST（U/L）ALT（U/L）TBil（μmol/L）PT（s）Alb（g/L）HBV⁃DNA（×103拷贝/mL）Galectin⁃9（ng/mL）PD⁃L1（%）32.86±7.09 32.07±8.51 16.55±4.19 12.69±1.29 40.83±3.96 7.75±1.07 1.65±0.47 1.39±0.28 33.85±8.13 33.19±7.62 17.41±4.58 13.02±1.25 40.34±4.07 8.90±1.24 2.24±0.62 1.68±0.37 0.730 0.771 1.099 1.449 0.683 5.588 6.072 5.004 0.467 0.442 0.274 0.150 0.496<0.001<0.001<0.001

表4 CHB 患者显著肝脏炎症多因素Logistic 回归分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis of significant liver inflammation in CHB patients

2.4 血清Galectin⁃9、PD⁃L1 对CHB 患者肝脏炎症程度的诊断价值

以显著肝脏炎症患者血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平为阳性样本，以轻度肝脏炎症患者血清Galectin⁃9、PD⁃L1 水平为阴性样本，绘制各指标诊断肝脏炎症程度的ROC 曲线，结果显示，Galectin⁃9、PD⁃L1 估于 单⁃诊断联合诊断AUC 最大，为0.850。见表5、图1。

图1 血清Galectin⁃9、PD⁃L1诊断肝脏炎症程度的ROC曲线Figure 1 ROC curve of serum Galectin⁃9 and PD⁃L1 in the diagnosis of liver inflammation

表5 血清Galectin⁃9、PD⁃L1 对肝脏炎症程度的诊断价值Table 5 The diagnostic value of serum Galectin⁃9 and PD⁃L1 on the degree of liver inflammation

3 讨论

CHB 具有发病率高、传染性强、难治愈等特点，病理改变主要为肝组织炎症坏死，活动性慢性炎症是导致CHB 肝纤维化、肝硬化，甚至肝癌的重要因素［10］。因此，早期评价显著肝脏炎症，及时采取个体化治疗，对抑制CHB 疾病进展，改善患者预后具有重要价值。但目前，临床仍缺乏可快速、有效评价肝脏炎症进展程度的手段，成为亟待解决的难题。

Galectin⁃9 属半乳凝素家族成员，是Tim⁃3 配体，作为新型酸性粒细胞驱化物，具有诱导T 细胞凋亡、促进酸性粒细胞趋化等多种生物学功能，参与自身免疫性疾病、急性炎性反应、过敏等的发生发展过程［11］。本研究显示，CHB 患者血清Galectin⁃9呈异常高表达，且CHB 患者血清Galectin⁃9 水平与HBV⁃DNA、炎症分级、纤维化分期均呈正相关，与相关研究［12］一致，提示Galectin⁃9 可能参与CHB 发生及病情进展。HBV 感染的慢性化与机体固有免疫及适应性免疫损伤密切相关，尤其T 细胞功能耗竭［13］。耗竭的T 细胞毒性杀伤、分泌效应因子及增殖能力降低，无法有效清除HBV，同时，过表达一些抑制性表面分子，如Tim⁃3、PD⁃L1 等，Tim⁃3 通过结合配体Galectin⁃9，诱导T 细胞功能耗竭［14］。多项研究表明，作为凝集素家族重要成员之一，Galectin⁃9 是病毒感染过程中发挥关键作用的免疫调控分子，发挥多种生物效应，如调控细胞黏附、影响树突状细胞成熟及Treg 细胞分化、抗病原微生物等［15］。HBV 感染后，肝内分泌大量干扰素（IFN）⁃β、IFN⁃γ，诱导Galectin⁃9 大量表达，与Tim⁃3结合后，使CD8+T 细胞增殖及分泌细胞因子的能力显著降低，进而促进病情进展［16］。Logistic 回归模型分析显示，血清Galectin⁃9 水平升高均为CHB患者显著肝脏炎症独立危险因素，进一步证实应用Galectin⁃9 有助于监测CHB 疾病进展。

CHB 免疫学机制一直是临床研究重点，患者一旦出现特异性T 细胞功能减退，就无法清除病毒，引起HBV 慢性化［17］。多项研究表明，PD⁃1/PD⁃L1信号通路可降低T 细胞表面受体传导的抗原信号，起到负性调节作用，可能在降低机体免疫清除HBV 能力方面起重要作用［18］。本研究结果也提示PD⁃L1 参与CHB 发生及发展。PD⁃L1 是PD⁃1 主要配体，属B7 家族成员，可负向调节免疫应答，这点不同于其他B7 家族分子。生理状况下，T 细胞、单核细胞、B 细胞PD⁃L1 表达处于较低水平，而HBV 感染后，淋巴细胞活化，PD⁃L1 表达增加（尤其T 细胞），肿瘤坏死因子⁃α（IFN⁃α）、粒细胞⁃巨噬细胞集落刺激因子（GM⁃CSF）、白介素⁃4（IL⁃4）等多种因子均可引起淋巴细胞表达PD⁃L1 增加［19］。另外，相较于PD⁃1 表达，PD⁃Ll 更加广泛，可在T 细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B 细胞、肝细胞、多种间质细胞等表面表达，在多种组织上调节免疫应答［20］。另ROC 曲线显示，血清Galectin⁃9、PD⁃L1 在肝脏炎症程度的诊断方面均具有一定价值，且二者联合诊断的AUC 达0.850，可为CHB 患者肝脏炎症程度诊断提供更准确数据参考。Galectin⁃9、PD⁃L1 参与CHB 患者免疫调节的作用机制不同，二者联合可更全面反映病变情况，从而为显著肝脏炎症评价提供更全面信息。

综上可知，CHB 患者血清Galectin⁃9、PD⁃L1 异常高表达，且可较准确地诊断肝脏炎症程度，利于监测CHB 疾病进展。但调节Galectin⁃9、PD⁃L1 相关通路可否改善CHB 患者免疫状态，达到抑制病情进展的目的，尚待进一步研究。