不同厂家小肠结肠炎耶尔森氏菌微量生化鉴定 试剂盒的比对

杨绪伟，林国强，卢勉飞，李艳嫦，蔡芷荷,2,3，吴清平

（1.广东环凯微生物科技有限公司，广东广州 510663） （2.广东省科学院微生物研究所，广东广州 510070）（3.广东环凯生物科技有限公司，广东肇庆 526238）

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）属于肠杆菌科，是重要的食源性致病菌之一。在过去的二十年间，欧、美等国家发生了多起的由该菌引起的食源性中毒事件[1-3]。小肠结肠炎耶尔森氏菌病（耶氏菌病）是20世纪80年代才受到重视的一种新的肠道传染病，不少地区耶氏菌引起的胃肠炎和严重腹泻，比痢疾还多，此菌甚至能引起败血症等疾病[4,5]。在欧洲，耶尔森氏菌病已继沙门菌病和弯曲菌病之后，排在第3位的常见肠道疾病，已成为流行最广泛的传染疾病之一。1981年我国才发现此病，通过全国性调查和研究，发现其在我国的分布非常广泛[6,7]。主要通过污染食品或水源，经粪-口途径传播，进而给人们造成危害。

由于小肠结肠炎耶尔森氏菌的危害性，并且广泛存在于食品中，对人们健康构成较大威胁，因此，小肠结肠炎耶尔森氏菌的分离鉴定对人类具有重要意义。很多国家都已将该菌列为食品的常规检测项目。鉴于小肠结肠炎耶尔森氏菌的特性，其检测流程较长，所以一些研究通过运用分子生物学的检测方法，如PCR法、LAMP法、免疫法和实时荧光RPA法等，快速筛选和传统培养分离相结合来进行检测该菌[8-12]，但是目前小肠结肠炎耶尔森氏菌的检测还是以常规分离鉴定技术为主[13]。基于传统生化鉴定原理开发的小肠结肠炎耶尔森氏菌商品化检验产品，还有API 20E和VITEK鉴定系统等，集成了更全面的生化反应，较传统生化试剂应用更为便捷[14]。但该类商品化产品的鉴定结果受其自身菌株数据库的限制，不能保证在种水平上进行准确鉴定，例如运用API20E试剂不能区分蔗糖反应阴性的小肠结肠炎耶尔森氏菌和克氏耶尔森氏菌[15]。耶尔森氏菌的基本生化反应特征为：过氧化氢酶阳性、氧化酶阴性、尿素酶阳性，发酵葡萄糖，大多数菌株不发酵乳糖等。通过以下生化反应：靛基质、V-P 试验、柠檬酸盐、L-鸟氨酸、蔗糖、纤维二糖、L-鼠李糖、蜜二糖和山梨醇，可以进一步鉴别耶尔森氏菌属菌株的生化特征差异[16]。国标GB 4789.8-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 小肠结肠炎耶尔森氏菌检验》[17]中列出了小肠结肠炎耶尔森氏菌及其他5种耶尔森氏菌的主要生化反应特征，用于属内鉴定区别。由于目前传统的生化鉴定管均为液体状态，存在运输不方便、稳定性差导致保质期短的问题，且西林瓶铝盖难开，特别是当实验非常多的情况下，给检验人员带来了很大的工作量。为了更好地对小肠结肠炎耶尔森氏菌进行鉴定，减轻检验人员的工作量，本实验室依据GB 4789.8- 2016[17]，以传统生化鉴定为基准，将传统液体鉴定试剂进行微量化和干燥化处理，研制出干燥态的、方便使用的小肠结肠炎耶尔森氏菌生化鉴定试剂盒。为评价本研究成果干燥态的鉴定试剂盒的鉴定效果，特与传统液态生化鉴定试剂盒和国内同类产品进行了比对，现将比对结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 试剂

本实验室研制的小肠结肠炎耶尔森氏菌生化鉴定试剂盒（以下简称EasyID），批号为A0027T；小肠结肠炎耶尔森氏菌干制微量生化鉴定试剂盒（简称KIT），批号为190508；广东环凯微生物科技有限公司生产的传统液态生化鉴定试剂盒（简称HKM），批号为5108306；胰酪胨大豆琼脂培养基（TSA），批号为1084731。

1.2 仪器与设备

BSC-1360-L B2Ⅱ 生物安全柜，北京东联哈尔仪器；HVE50灭菌锅，日本HIRAYAMA；DNP-9162电热恒温培养箱，广东环凯微生物科技有限公司。

1.3 菌株

共使用36株试验株，其中分离株来源于各类食品，目前这36株菌株均来自广东省食品微生物安全工程研究中心（种群统计见表1），试验株具体编号如下：

表1 试验菌株种群统计 Table 1 Population statistics of test strains

小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）：2株标准株：CMCC(B)52204、CICC21565；19株分离株：FSCC(I)234024、FSCC(I)234074、FSCC(I)234112、FSCC(I)234128、FSCC(I)234133、FSCC(I)234138、FSCC(I)234142、FSCC(I)234144、FSCC(I)234150、FSCC(I)234152、FSCC(I)234166、FSCC(I)234169、FSCC(I)234172、FSCC(I)234174、FSCC(I)234198、FSCC(I)234202、FSCC(I)234203、FSCC(I)234207、FSCC(I)234208；弗氏耶尔森氏菌（Y. frederiksenii）：5株分离株：FSCC(I)234240、FSCC(I)234242、FSCC(I)234263、FSCC(I)234299、FSCC(I)234309；中间型耶尔森氏菌（Y. intermedia）：5株分离株：FSCC(I)234030、FSCC(I)234060、FSCC(I)234214、FSCC(I)234262、FSCC(I)234268；克氏耶尔森氏菌（Y.kirstensenii）：5株分离株：FSCC(I)234061、FSCC(I)234086、FSCC(I)234095、FSCC(I)234122、FSCC(I)234274。

1.4 方法

EasyID使用定方法：取鉴定条及悬浮培养基，使用前平衡至室温；从新鲜培养的TSA平板上挑取可疑单菌落接种于悬浮培养基中，制成0.5麦氏浊度的均一菌悬液；从底座上取下鉴定条，并从鉴定条右侧向左掀开贴膜，用微量移液器小心注入2 mL菌悬液于分液槽中，贴回贴膜，并依次抬起左右两侧数次，使菌液液面达同一高度，然后水平托起分液槽端，确保菌液流入各反应孔中，贴紧薄膜并放回底座。再次从右侧掀开贴膜，向第6号孔准确添加30 μL发酵添加剂，再分别向第7、8号孔中各滴加3～4滴无菌液体石蜡，贴紧薄膜。将已接种的鉴定条放置26 ℃培养箱；培养完毕后，按附件1记录1～8孔结果；向第9孔滴加VP试剂甲液3滴，乙液2滴，不贴紧贴膜，暴露空气放置10 min后，再观察并记录结果。

KIT和HKM按照相关产品说明书进行操作。

主要典型生化特征如下表2。

表2 小肠结肠炎耶尔森氏菌与其他相似菌的生化性状鉴别表 Table 2 Identification of biochemical characters between Yersinia enterocolitica and other similar bacteria

2 结果与讨论

2.1 两种干制鉴定试剂盒与传统液态生化鉴定试剂盒的比较

用HKM、EasyID和KIT三种试剂盒对36株测试菌株进行鉴定，鉴定结果见表3。与HKM相比，EasyID和KIT两种试剂中V-P试验、鸟氨酸脱羧酶、蔗糖、山梨醇、甘露醇、鼠李糖6个反应符合率均为100%，尿素酶的符合率均为97.22%；26 ℃下EasyID的动力符合率为100%，优于KIT（88.89%）；此外EasyID的棉子糖符合率为100%，优于KIT（97.22%）。两种干制鉴定试剂盒EasyID和KIT与传统液态生化鉴定试剂盒HKM鉴定结果相比，总体符合率分别为99.69%、98.15%，EasyID相比KIT，与HKM的符合率更高。

表3 两种鉴定试剂盒与传统生化管的符合率 Table 3 Coincidence rate between two identification kits and traditional biochemical tube

2.2 三种鉴定试剂盒和国标典型特征的比较

以国家标准给出的典型生化特征为标准[9]，参照表2对三种鉴定试剂盒各反应的结果进行判定，统计出36株测试菌株的符合率，结果如下表4。与国标典型特征相比，三种试剂盒中鸟氨酸脱羧酶、蔗糖、山梨醇、甘露醇、鼠李糖5项反应符合率均为100%，V-P试验的符合率均为94.44%，这6项反应三种试剂盒效果相当；26 ℃下EasyID和HKM的动力符合率均为100%，优于KIT（88.89%）；EasyID和KIT的尿素酶符合率均为100%，优于HKM（97.22%）；此外，EasyID和HKM棉子糖的符合率均为100%，优于KIT（97.22%）。EasyID、HKM和KIT三种鉴定试剂盒与标准要求相比总体符合率分别为99.37%、99.07%、97.83%，EasyID总体平均符合率略高于HKM和KIT，其中KIT最差。

表4 三种鉴定试剂盒与典型特征的符合率 Table 4 Coincidence rate of three identification kits with typical characteristics

2.3 详细异常数据

本次试验的结果异于国标给出的典型生化特征的实验数据，见表5。KIT试剂盒异常项目中包括了小肠结肠炎耶尔森氏菌和弗氏耶尔森氏菌的动力试验、中间型耶尔森氏菌的棉子糖试验和弗氏耶尔森氏菌的V-P试验共3个反应，占数最多；其次是HKM包含了克氏耶尔森氏菌的尿素酶试验和弗氏耶尔森氏菌的V-P试验共2个反应；EasyID异常的仅有弗氏耶尔森氏菌的V-P试验1个反应。

表5 详细异常数据 Table 5 Detailed abnormal data

3 结论

3.1 由表5的异常数据分析可知，动力、尿素酶、棉子糖、V-P试验3个反应的生化特征与国标的典型生化特征不一致。其中动力、尿素酶和棉子糖3个反应是单一试剂的异常；而V-P试验反应则是3种试剂一致的异常，3种试剂的异常结果都呈假阴性。通过查阅伯杰细菌鉴定手册可知，弗氏耶尔森氏菌的V-P试验没有26 ℃的数据，只有36 ℃的数据，其阳性率为0。根据这一阳性率和三种试剂鉴定出的该反应为一致的阴性，可以确定这2株弗氏耶尔森氏菌的分离株V-P试验生化特征应该为阴性。

3.2 通过使用EasyID和KIT两种生化鉴定试剂盒进行试验，根据试验操作过程中的易用性进行综合比较。KIT的条掀开盖子后，需在长槽里加无菌水来维持湿度，加样的时候需要单孔添加菌悬液，虽操作比较简单，但是比较耗时；而EasyID上方覆盖有封口贴膜，可以防止在培养过程中液体过度蒸发，不需要额外加水维持湿度；接菌的时候轻轻撕开部分贴膜，采用一步加样与分液技术，把菌悬液一次加到鉴定条的分液槽里再贴回贴膜，左右抬起鉴定条的两端使液面达到同一高度，然后水平托起分液槽端，使菌悬液流入各个反应孔。这种采用一步加样的方法，减少了错加漏加的风险，同时提高了加样效率，在两种试剂易用性中体验最好。

3.3 EasyID和KIT两种鉴定试剂盒都是培养18～24 h就可以观看结果，灵敏性一致。在观看结果方面，EasyID试剂的反应孔是圆孔倾斜依次排列，每个反应孔培养后的颜色一目了然，色泽清晰可见，判读和记录结果方便快捷；相比较KIT在观看结果时则没这么直观，需在试剂下方垫一张白纸才能完全看清反应孔里的颜色，判读结果时显的比较困难。

3.4 本研究依据国家标准研制出了小肠结肠炎耶尔森氏菌微量化干燥态生化鉴定试剂盒，使得小肠结肠炎耶尔森氏菌鉴定更快速化、微量化和简易化，大大减轻了检验人员的工作量，以及减少了加工、储藏、运输过程中的人力物力，延长了鉴定试剂的保存期。