屎肠球菌132胆盐水解酶基因的克隆表达与酶学特性

杨玲双，谢新强，李滢，张菊梅，丁郁，吴清平*，王涓

（1.华南农业大学食品学院，广东广州 510642）（2.广东省科学院微生物研究所，广东省微生物安全与健康重点实验室，华南应用微生物国家重点实验室，广东广州 510075）

甘氨酸或牛磺酸结合胆汁酸被称为胆盐[1]，是哺乳动物消化脂质所必需的。胆盐水解酶（bile salt hydrolase，BSH），也称为结合BSH（conjugated bile salt hydrolase，CBSH）、结合胆汁酸水解酶（conjugated bile acid hydrolase，CBAH）和胆酰甘氨酸水解酶（cholylglycine hydrolase，CGH），属于N端亲核水解酶家族[2]，是一种催化甘氨酸/牛磺酸结合胆汁酸水解为去结合胆汁酸和氨基酸残基的酶[3]。BSH主要来源于梭菌（Clostridium）、拟杆菌（Bacteroides）、乳杆菌（Lactobacillus）、李斯特菌（Listeria）、肠球菌（Enterococcus）、双歧杆菌（Bifidobacterium）等[4]。具有BSH活性的微生物能耐受胆汁、在胃肠道定殖、维持宿主代谢和能量获取的能力[5]。BSH酶能将结合胆盐水解成去结合形式和释放游离氨基酸，而去结合胆盐的可溶性较差，不被肠细胞吸收而随粪便排出体外；另一方面则是促进胆汁酸合成，因胆固醇为胆汁酸的前体，故能降低血清胆固醇[6]。益生菌对胆盐的水解能力经常被列入益生菌菌株筛选的标准之一，但不同微生物的BSHs具有不同的蛋白结构和底物特异性，潜在BSH抑制剂的鉴定依赖于BSH的晶体结构的可用性[7,8]。不同种属之间BSH的亚基组成、大小、最适温度、pH均存在差异性，但BSH有6个严格的保守催化位点，其中Cys2埋藏在所有Ntn酶保守的αββα核心中形成活性位点，另外还有5个重要的催化残基（Arg18、Asp21、Asn82、Asn175、Arg228）[9]。乳杆菌和双歧杆菌作为有益微生物的代表，其BSH酶被广泛研究，比如植物乳杆菌WCFS1发现有4个bsh基因[10]，约氏乳杆菌PF01发现3个bsh基因[11]，嗜酸乳杆菌NCFM发现2个bsh基因，且均显示不同的底物特异性[12]。在唾液乳杆菌JCM1046和UCC118中也发现了2个bsh基因，其中第二个基因在分类水平上被重新编码为青霉素V酰基酶（PVA）[13]。屎肠球菌广泛存在禽类肠道中，是肠道中重要的菌类，因其能产生乳酸，故归属于乳酸菌。近年来，益生屎肠球菌越来越受到关注，益生肠球菌对维持平衡起到关键作用，近年来广泛应用在幼龄动物的肠道保健和疾病防疫上[14]。屎肠球菌还能产生抗菌肽，抑制致病菌的生长，在食品中添加能延长食品保质期等功能，但对其BSH研究相对较少。本团队前期对屎肠球菌132全基因组序列注释结果发现，屎肠球菌132含有胆酰甘氨酸水解酶（EC 3.5.1.24）基因。并且在体内能降低SD大鼠体重、血清胆固醇、甘油三酯、缓解肝损伤[15]。有综述报道抑制肠道BSH活性会增加脂质代谢和获取能量，从而提高饲料动物的生长性能和饲料效率[16]，故对BSH研究具有重要意义。本研究对屎肠球菌132bsh基因进行异源表达纯化，探究不同底物、pH、以及温度对酶活力的影响，为进一步研究屎肠球菌相关胆盐水解酶以及潜在降胆固醇机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌株和质粒

屎肠球菌132（Enterococcus faeciumstrain 132）、大肠杆菌ATCC 8739（Escherichia coliATCC 8739）、pET-28a (+)质粒由广东省微生物研究所微生物安全与健康发展中心团队保藏提供。DH5α、BL21大肠杆菌感受态细胞购自生工生物工程（上海）有限公司。

1.1.2 培养基

MRS（de Man，Rogosa and Sharpe）固体和液体培养基、LB（Luria-Bertani）固体和液体培养基，购自广东环凯微生物科技有限公司；

发酵培养基：35 g/L胰蛋白胨、20 g/L酵母粉、5 g/L NaCl。

1.1.3 主要生化试剂

甘氨酸、牛磺酸、甘氨胆酸钠（GCA）、甘氨脱氧胆酸钠（GDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸钠（GCDCA）、牛磺胆酸钠（TCA）、牛磺脱氧胆酸钠（TDCA）、牛磺鹅脱氧胆酸钠（TCDCA）、DMSO、β-巯基乙醇，上海麦克林生物科技有限公司；CaCO3、柠檬酸三钠、EDTA（Ethylene Diamine Tetraacetic Acid），咪唑，广州化学试剂厂；茚三酮显色液，上海罗恩试剂；DL2000 DNA Marker，广州东盛生物有限公司；Nhe Ⅰ、Xho Ⅰ限制性内切酶、Pushion master mix、T4DNA Ligase、cut@smart buffer，美国NEB公司；PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒，美国omega公司；SDS-PAGE上样缓冲液、标准蛋白Marker，上海碧云天生物技术有限公司。

裂解液（g/L）：NaCl 5.60 g、NaH2PO40.63 g、咪唑4.76 g，pH 7.60～7.80。

洗脱液（g/L）：NaCl 8.40 g、NaH2PO42.18 g、咪唑13.60 g，pH 7.20。

交换液（g/L）：NaCl 5.60 g、NaH2PO42.18 g、pH 7.20。

1.2 仪器与设备

WBK-4B型电热恒温水浴锅，广东环凯微生物科技有限公司；Seven CompactTMS210型数字pH计，美国Mettler Toledo公司；Microfuge®16台式冷冻离心机，美国Beckman Coulter公司；EPOCH2酶标仪，美国Biotek公司；C150凝胶成像系统，美国Azure Biosystems公司；Biometra DNA扩增循环仪，德国Biometra公司。

1.3 实验方法

1.3.1 胆盐水解酶活力分析

MRS固体培养基中加0.20%牛磺脱氧胆酸钠、0.37 g/L CaCl2，121 ℃灭菌20 min，倒平板晾干。再将无菌滤纸片均匀放入平板上，每个滤纸片均匀滴加10 μL菌液，37 ℃厌氧培养72 h。观察滤纸周围有无沉淀圈出现[17]。若平板中出现沉淀圈，说明菌株可能具有潜在胆盐水解酶活性。

菌体胆盐水解酶的定量分析[18]：将屎肠球菌132接种于MRS肉汤中，大肠杆菌ATCC 8739接种于LB肉汤中37 ℃培养18 h，培养液经8000 ×g离心5 min后收集菌体，用无菌的PBS缓冲液洗涤两遍后将菌体重悬于PBS缓冲液中。取1 mL菌悬液，加1 μL 1 mol/L维生素C进行破碎（30%功率，6 s停4 s，100 min），13000 ×g离心3 min收集上清，即为粗酶液。利用改良Bradford蛋白浓度试剂盒测定粗酶液蛋白浓度，并绘制蛋白浓度标准曲线。粗酶液对甘胆酸钠解离体系如表1所示。

表1中溶液温和涡旋混匀后于37 ℃孵育30 min，置于高温使酶失活，于16000 ×g离心10 min，吸取250 μL茚三酮显色液加入750 μL上清中，同时配制标准曲线样品浓度（0、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mmol/L）；将样品、对照、空白1、空白2、标准曲线样品于显色液振荡混匀，沸水浴15 min，冰浴3 min，静置5 min后于OD570处测吸光度。实际吸光度值=样品吸光度值-空白1吸光度值-空白2吸光度值。

表1 胆盐水解酶酶促反应 Table 1 Bile salt hydrolysase enzymatic reaction

BSH总酶活定义为：单位时间内、单位体积的酶液使结合型胆盐水解产生氨基酸的微摩尔数，单位μmol/(min·mL)；1U=μmol/min。

BSH比酶活定义为：单位时间内、单位质量的总蛋白中的酶液使结合型胆盐水解产生氨基酸的微摩尔数，单位μmol/(min·mg)。

1.3.2 DNA的提取和引物设计

利用团队前期全基因组测序信息中找到相关bsh基因（GenBank登录号：MZ031135），总片段长度为975 bp，以NheⅠ和XhoⅠ为双酶切位点，引物为BSHf：5’-AAAAAAGCTAGCATGTGTACGTCTATTA CTTATGTAAC-3’，和BSHr：5’-GTGGTGCTCGAGC TAATTTATATATTTAATTTGTTG-3’，引物由苏州金唯智生物科技有限公司合成。将培养好的菌体，按照广州美基生物技术有限公司细菌基因组DNA提取试剂盒方法，提取基因组DNA。

1.3.3 目的基因的克隆、表达载体的构建

利用上述基因组DNA和引物进行PCR扩增，扩增体系（50 μL）：上下游引物各2.5 μL（10 μmol/L）、DMSO 1.5 μL、Pushion master mix 25 μL、模板DNA 1 μL、灭菌超纯水补足50 μL。反应条件：98 ℃预变性30 s；98 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳中进行验证。利用美国omaga公司产物纯化试剂盒（D6492-03）进行PCR产物纯化，选取pET-28a (+)质粒和PCR产物进行双酶切，酶切体系（50 μL）：Nhe Ⅰ2 μL、Xho Ⅰ2 μL、cut@smart buffer 5 μL、pET-28a (+)质粒/PCR产物25 μL，灭菌超纯水补足50 μL，酶切2 h后对酶切PCR产物进行纯化，利用Omega公司胶回收试剂盒（D2500-02）对酶切质粒进行胶回收。利用T4连接酶对酶切PCR产物和回收质粒进行酶连反应，16 ℃过夜连接并导入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，利用抗性基因（卡那霉素）平板筛选进行菌落PCR、双酶切验证，提取质粒送至苏州金唯智生物技术有限公司进行测序，利用DNAMAN 9软件进行同源比对，确定插入序列是否正确，命名正确的质粒为pET-28a-BSH。最后将提取得到的正确质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞用于异源表达。

图1 重组质粒构建示意图 Fig.1 Schematic diagram of recombinant plasmid construction

1.3.4 BSH的异源表达和纯化

将含有pET-28a-BSH的大肠杆菌BL21接种于含卡那霉素的发酵培养基中，37 ℃、200 r/min，培养4 h后调整温度为18 ℃，加终浓度至0.4 mmol/L IPTG进行诱导表达，诱导48 h后，10000 ×g，离心20 min，收集菌体重悬于含0.1%溶菌酶裂解液中，放-80 ℃中备用。

将菌体进行冰浴超声破碎（30%功率，6 s停4 s，30 min），4 ℃离心取上清，过0.8 μm滤膜即得到粗酶液。粗酶液过HisTrap Fast Flow镍柱[19]（Cyctiva厂家，美国丹纳赫集团），用裂解液洗脱杂质蛋白，再利用洗脱液洗脱目的蛋白，30 ku超滤管浓缩目的蛋白，交换液重悬和离心除去咪唑，用蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白定量，纯化蛋白中加20%甘油，保存于-80 ℃冰箱，备用。

1.3.5 BSH酶的底物特异性分析

反应体系：20 μL酶液、0.5 μL 1 mol/L维生素C溶液、100 μL pH=6、6 mmol/L胆酸盐、80 μL的双蒸水，轻轻充分混匀后置于37 ℃恒温水浴锅中孵育30 min，反应结束后置于高温使酶失活，于16000×g离心10 min，上清加入60 μL茚三酮显色液，迅速置于沸水浴中反应15 min，冰浴3 min，静置5 min后于570 nm处测吸光度，以不加酶液为对照。样品实际吸光度值=吸光度值-对照吸光度值。根据甘氨酸标准曲线计算生成的氨基酸的量，计算比酶活，以最高酶活力为100%，计算相对酶活，重复三次实验。

胆酸盐分别为6 mmol/L GCA、6 mmol/L GDCA、6 mmol/L GCDCA、6 mmol/L TCA、6 mmol/L TDCA、6 mmol/L TCDCA。

1.3.6 BSH的最适pH和pH稳定性

以6 mmol/L GCA为底物，将反应体系（详见1.3.5）分别置于不同pH（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）下反应按1.3.5方法计算相对酶活。

以6 mmol/L GCA为底物，将不加底物的反应体系分别置于不同pH（3.0、4.0、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）下孵育1 h，置于1.3.5方法进行反应并计算相对酶活。

1.3.7 BSH的最适温度和热稳定性

6 mmol/L GCA为底物，将反应体系（详见1.3.5）分别置于不同温度（4、20、30、40、50、60、70 ℃）下反应，按1.3.5方法计算相对酶活。

6 mmol/L GCA为底物，将不加底物的反应体系分别置于不同温度（4、20、30、40、50、60、70 ℃）下孵育1 h，置于1.3.5方法进行反应并计算相对酶活。

1.3.8 不同金属离子对BSH活力的影响

6 mmol/L GCA为底物，反应体系（详见1.3.5）中分别加入终浓度为5 mmol/L不同金属离子（NaCl、CaCl2、MgSO4、MnCl2·4H2O、FeSO4·7H2O、LiCO3、Al2(SO4)3·8H2O、NiSO4·6H2O、CoSO4·7H2O、ZnSO4），测定相对酶活，以未加金属离子的比酶活为100%。

1.3.9 BSH反应动力学参数的测定

将不同浓度（2、4、6、8、10、20 mmol/L）的GCA加入1.3.5反应体系中反应30 min，按1.3.5方法计算相对酶活。利用GraphPad Prism 8.4.3软件，根据米氏方程（Michaelis-Menten）拟合数据，并计算BSH最大反应速率（Vmax），米氏常数（Km）值。

1.3.10 数据处理

结果以实验的均数±标准差（mean±SD）表示，每次实验3次重复。采用Microsoft Excel 365软件计算平均值和SD值，Graph Pad 8.4.3进行绘图。利用在线软件Swiss Model对BSH的3-D结构进行了同源模拟。

2 结果与分析

2.1 菌体破碎液胆盐水解酶活力的测定

屎肠球菌132在含牛磺脱氧胆酸钠MRS平板上具有明显的沉淀圈（图2），推测屎肠球菌132可能具有胆盐水解酶活性。经胆盐水解酶定量分析结果表明，屎肠球菌132总酶活为0.20 U/mL，比酶活为0.55 U/mg。先前有研究报道，张芬[20]利用茚三酮法，以GDCA为底物，测定10株肠球菌的比酶活在0.11～1.86 U/mg，本研究屎肠球菌132比酶活力处于中等水平。

图2 屎肠球菌132胆盐水解酶定性分析 Fig.2 Qualitative analysis of bile salt hydrolyase in E. faecium strain 132

2.2 表达载体的构建和BSH的纯化

目的基因经过克隆、重组质粒到质粒导入BL21感受态细胞后进行诱导表达，利用超声破碎菌体收集上清并过镍柱纯化。如图3a所示，在1000 bp左右，出现一条清晰的目的条带，表明BSH克隆成功；纯化蛋白经SDS-PAGE蛋白凝胶实验得到一条清晰明亮的条带（图3b），条带大小约为37 ku，为常见BSH蛋白条带，说明BSH蛋白被成功表达并纯化。有研究报道屎肠球菌包含两个bsh基因，且这两个基因长度均为975 bp，条带大小在37 ku左右[20]，而本研究bsh基因，条带大小与之一致。

图3 纯化的BSH蛋白SDS-PAGE Fig.3 Purified SDS-PAGE of purified recombinant BSH protein

2.3 BSH的底物特异性

为探究BSH的底物特异性，利用茚三酮显色法对6种结合胆盐进行底物特异性分析。结果如图4所示，pH=6对GCA解离中酶活达4.93 U/mg，相比于粗酶液，酶活力增加了近10倍（每次比酶活/粗酶液比酶活）。BSH对GCA、TCA均较高的酶活力，对GDCA、GCDCA、TDCA的相对酶活能达到80%，TCDCA特异性最差，达60%。不同种属酶的活性位点、底物特异性稍有差异。有研究报道，屎肠球菌WEFA23对GDCA水解能力较强[20]，与本研究结果较为一致，对甘氨胆酸类水解能力较强。而另一个研究则报道屎肠球菌NW2对TDCA水解最强，但对GCA的水解也能达到82%[21]，而本研究对这两种结合胆酸的水解均都大于80%，与之结果较为类似。BSH的底物特异性也可能归因于酰胺键附近的空间位阻，随着酰胺键附近空间位阻的增加，胆盐水解速率降低[22]。BSH对底物特异性有所差异，对甘氨结合胆酸活性最高，故选取GCA为底物进行酶学特性研究。

图4 BSH的底物特异性 Fig.4 Substrate specificity of recombinant BSH

2.4 BSH最适pH及pH稳定性

在不同pH条件下反应并测定BSH的相对酶活，结果如图5a所示，在pH=5.50时达到最高比酶活，达6.59 U/mg，与文献报道的屎肠球菌NW2中BSH2最适pH相一致[21]；当pH=5时，BSH相对酶活下降至80%；pH＞7时酶活开始急剧下降；pH=10时下降至20%；pH＜4时BSH酶活几乎丧失。BSH适应pH范围较广，在pH=5～10均有一定的活性。当酶经1 h的不同pH缓冲液孵育后，pH＜4时BSH酶活几乎丧失，与乳杆菌属100-100菌株来源的BSH（pH 3.80～4.50）差别较大[23]，说明其稳定性较差；在pH为5～7时，酶稳定性较好，与长双歧杆菌SBT2928来源的BSH（pH 5～7）较为一致[24]；pH＞7时酶活开始急剧下降；pH=10时下降至20%，稳定性开始下降，可能由于结构遭到破坏造成稳定性差，表明该酶对高酸碱均不耐受。任婧[25]在综述中提到，甘氨类胆盐在酸性条件下有非常强的毒性，此时BSH则优先水解甘氨类胆盐，因其大部分研究BSH的最适条件都是以甘氨类胆盐为底物，故会得出BSH倾向微酸性条件（pH=5～6）。

图5 BSH最适pH及pH稳定性 Fig.5 The optimal pH and the pH stability of BSH

2.5 BSH最适温度及热稳定性

测定不同温度条件下BSH的相对酶活，结果如图6a所示，在30 ℃表现出最高酶活力，与屎肠球菌NW2中BSH2相一致[21]，当温度在4～60 ℃范围时均有较高的酶活力，4～60 ℃酶活力均大于60%；当温度高于60 ℃时，酶活力迅速下降，当温度达70 ℃时，相对酶活下降至20%。故BSH在4～60 ℃均有较高酶活。将酶置于不同温度下孵育1 h，再按1.3.5体系进行反应并测定相对酶活。从图6b可以看出，当温度4～30 ℃范围时，相对酶活达80%，这与双歧杆菌来源的重组BSH热稳定性较为一致[19]；而当温度＞40 ℃时，酶活急剧下降至20%，热稳定性较差。与植物乳杆菌[26]BSH相比，本研究的BSH耐受pH和热稳定性范围较窄，这可能是由于不同来源和结构所导致。结果表明BSH不耐受高温，为常温酶。

图6 BSH最适温度及热稳定性 Fig.6 The optimal temperature and thermal stability for BSH

2.6 不同金属离子对BSH活力的影响

不同的金属离子往往对酶会产生激活或者抑制作用，通常作为酶的激活剂或者抑制剂，故本研究在酶反应体系中加入不同金属离子，探究其对酶的竞争或者抑制作用。结果如表2所示，Na+、Ca2+、Mg2+均对酶活有激活作用，为该酶的激活剂；Mn2+、Fe2+对酶活影响不大；但Ni2+、Al3+、Li2+、Co2+、Zn2+均对酶活有强抑制作用，酶活几乎丧失，为该酶抑制剂。赵瑞香[27]等研究嗜酸乳杆菌BSH对Mn2+、Fe2+、Ca2+、Mg2+对BSH活性有促进作用，周罗雄等[21]研究屎肠球菌NW2BSH活力时发现Co2+抑制BSH活性，与本研究均具有较好的一致性。这可能是因为不同离子对酶结构存在破坏作用，影响稳定性。

表2 不同金属离子对BSH活力的影响 Table 2 The effect of different metal ions on the activity of recombinant BSH

2.7 BSH反应动力学参数的测定

以GCA为底物，测定BSH反应动力学参数。Km值是底物亲和常数，Vmax为酶促反应最大反应速率，利用米氏方程拟合曲线。结果如图7所示，米氏曲线呈S型，酶与底物在催化反应时表现出不同的协同作用。根据拟合曲线算出Km值为3.16 mmol/L，Vmax为6.44 μmol/(min·mg)。与报道的干酪乳杆菌[28]（Km值=4.57 mmol/L）相近，而与脆弱拟杆菌[29]（Km值=0.35 mmol/L）有明显差别，不同菌株BSH的Km值差异较大，可能由于不同底物、不同来源菌株或者不同BSH结构所造成，这一现象为揭示酶与底物的作用机理和酶的空间结构关系提供参考。

图7 BSH反应动力学 Fig.7 Kinetics of recombinant BSH reaction

2.8 BSH 3-D结构同源模拟

利用在线软件Swiss Model对BSH的3-D结构进行了同源模拟，结果如图8所示，该酶有324个氨基酸残基组成，与来源于粪肠球菌胆盐水解酶Cys2Ala突变体晶体同源性最高，达82.04%。用计算绝对模型质量的函数QMEAN评估模拟得到的模型的可靠性[30]。QMEAN范围为0～1，得到的值越大，说明模型越可靠，该模型QMEAN值为0.77、全球模型质量评估（Global model quality estimate，GMQE）值为0.94，说明模拟的BSH的3-D结构是较为可靠的。

图8 BSH 3-D结构同源模拟结构模型 Fig.8 Three-dimensional homology simulation of recombinant BSH structure model

3 结论

基于本研究前期发现屎肠球菌132具有降胆固醇功能且改善大鼠相关脂质代谢，通过全基因组测序发现其含有一个bsh基因，首先确定其细胞破碎液具有胆盐水解酶活力，并且构建了bsh基因表达载体。通过在大肠杆菌BL21中表达并纯化得到BSH，对其进行酶学特性研究。研究结果表明，BSH偏好水解甘氨酸类胆酸盐，但是对牛磺酸类胆酸盐水解也能达60%～90%；当以GCA为底物、pH=5.50、温度为30 ℃时达最适反应条件，BSH在偏酸中性中能保持较高的酶活但是该酶热稳定性较差；不同金属离子对酶活有不同影响，且该酶反应动力学得出该酶的Vmax为6.44 μmol/(min·mg)，Km值为3.16 mmol/L。本研究主要探讨屎肠球菌132体外BSH活性，通过构建BSH表达载体，探究pH、温度、不同金属离子对该酶酶活的影响，后续可进一步研究BSH空间结构和潜在活性位点的关系，或选用食品级乳酸菌表达系统表达bsh基因，为在饲料和食品行业中应用奠定理论基础。