静电纺丝法制备白藜芦醇固体分散体及其释药机制综合实验设计

周 军，邓 姣，张 胜，李湘洲

（中南林业科技大学材料科学与工程学院，长沙 410004）

0 引言

林产化工专业旨在培养利用植物资源开发绿色化工产品、生物医药材料和清洁能源的高级复合型科研与应用人才［1］。因此，在系统学习天然药物化学、生物制药工艺学、天然产物化学检测技术等基础理论课程知识和开展相关实验教学项目的同时，针对复杂的科研与生产实际问题，在实验教学环节探索并开设综合性、创新性的实验项目，有利于推进“新工科”背景下的实验教学改革［2-3］，夯实学生的专业基础知识，提高学生解决实际问题与自主创新的能力。

林源活性成分高效修饰与新型制剂开发是林产化工领域研究的热点，已开发的诸如紫杉醇脂质体、白藜芦醇微胶囊、银杏内酯注射液等制剂已广泛应用于抗癌药物、抗氧化食品等行业中［4-6］。白藜芦醇（Resveratrol）是一种非黄酮类天然多酚化合物，广泛存在于桑椹、葡萄、花生等植物组织中［7-8］。研究表明，白藜芦醇具有抗氧化、保护心血管以及抗肿瘤等多种生理活性［9-10］。但白藜芦醇是脂溶性物质，难溶于水以及稳定性差的天然缺陷使其难以被人体吸收利用，极大地限制了白藜芦醇产品的开发与应用。利用制剂制备技术可以有效改善白藜芦醇的天然缺陷。目前已开发的剂型有乳液、微胶囊、脂质体、固体分散体和脂质纳米液晶等。其中固体分散体是指将药物高度分散于固体载体中形成的一种以固体形式存在的药物-载体的固体分散系统［11］。固体分散体的释药性能与制备方法及载体材料密切相关。常用的制备方法有溶剂法、熔融法、喷雾干燥法、静电纺丝法等［12-13］。静电纺丝技术作为一种新兴的制备技术，其制备的固体分散体具有比表面积大、结构可控和生物相容性好等优点，已在药物载体、组织工程支架等方面有较好的应用［14］。紫胶作为药物的天然载体材料，因其结构中羧基基团的存在而具有一定的肠溶特性［15］，在载体材料中加入L-组氨酸（L-Histidine），能促进羧基在模拟肠液中的解离［16］，从而表现出优良的肠溶特性。

设计的静电纺丝技术制备白藜芦醇固体分散体的综合实验，比较了加入L-组氨酸前后制备的白藜芦醇固体分散体的形貌结构、稳定性以及释药性能与机理。选取特色林源活性成分，利用新兴制剂制备技术对其进行剂型改造以克服其天然缺陷，有助于学生深入理解专业基础知识，了解行业前沿动态，激发学生创新思维，提高实践能力与科学素养，促进学生对专业的认同感和归属感。

1 实验设计

1.1 实验试剂与仪器

（1）主要试剂与材料。紫胶树脂、氢氧化铵、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，98%白藜芦醇，花垣恒远植物生化有限公司；99%L-组氨酸，上海麦克林生化科技有限公司，透析袋（MD34，3500D），Sigma Aldrich。

（2）主要仪器。NANON-01A 静电纺丝机，MECC；UV2310II紫外分光光度计，上海天美科学仪器有限公司；Sigma HD 场发射扫描电子显微镜，Zeiss；ALPHA傅里叶变换红外光谱仪；Q2000 差示扫描量热仪，TA Instruments；RC-3 溶出度测定仪，天津新天光分析仪器技术有限公司；SCIENTZ-18N 冷冻干燥仪，宁波新芝生物科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 紫胶铵盐的制备

称取粉碎并过40 目筛的紫胶10.00 g，加入200 mL的0.1 mol／L 氨水中，于40 ℃下恒温磁力搅拌1 h，所得反应溶液静置，取上层清液装入表面皿中，于-18 ℃预冻8 h，经冷冻干燥48 h 得到褐色的紫胶铵盐。

1.2.2 静电纺丝制备白藜芦醇固体分散体

称取0.222 g纯白藜芦醇分散于含1.998 g 紫胶铵盐的无水乙醇溶液中，45 ℃下搅拌1 h 使其完全溶解，加入0.75 mg L-组氨酸后继续搅拌5～6 h，冷却至室温，得到紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇溶液。不加组氨酸的溶液为紫胶铵盐／白藜芦醇溶液。样品溶液经超声处理60 s，排除气泡后进行静电纺丝。设置仪器参数为电压29 kV，流速0.2 mL／h，针头清洗频率50 s／次，温度（25±5）℃，湿度42% ±5%，纺丝样品通过铝箔锡纸收集，接收距离15.0 cm，即得到粉末状的紫胶铵盐／白藜芦醇和紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇样品，备用。

1.2.3 固体分散体中白藜芦醇载药率的测定

分别称取一定量的紫胶铵盐／白藜芦醇和紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇样品，用乙酸乙酯反复淋洗3 遍，过滤，滤液定容，用紫外-可见分光光度计在305 nm处测定吸光度，根据标准曲线（y＝141.5x+0.004 7，R2＝0.999 6，在1.2～6.0 mg／L 范围内拟合效果较好）计算表面未包埋的白藜芦醇的质量，并分别计算白藜芦醇的载药率：

式中：LC为白藜芦醇的载药率，%；m为固体分散体的质量；m0为白藜芦醇的加入量；m1为未包裹的白藜芦醇的质量。

1.2.4 扫描电镜分析

分别取适量的样品粘在有导电胶的样品台上，利用真空镀膜机喷金后，再用扫描电镜观察样品的表观形貌，并利用Nano measure 软件对粒径分布进行统计分析。

1.2.5 傅里叶红外光谱分析

分别取适量的样品与干燥的溴化钾混合，研磨均匀后压片，样品在红外光谱下进行分析，扫描频率64 Hz，扫描32 次，扫描范围400～4 000 cm-1。

1.2.6 差示扫描量热法分析

分别取适量样品置于铝制小坩埚中，封压后放入差示扫描量热仪中进行分析，测量温度范围25～350℃，升温速率10 ℃／min。以液氮为降温介质，加热过程中均以高纯氮气为吹扫气和保护气。

1.2.7 体外释放效果及其动力学

根据2015 版中国药典溶出度和释放度测定法选用第2 法桨法测定样品的体外释放效果［17］。分别精密称取含白藜芦醇同等质量的紫胶铵盐／白藜芦醇、紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇样品和纯白藜芦醇置于已预处理的透析袋中，加入少量缓冲介质后封闭，置于含400 mL pH ＝6.8 的模拟肠液的溶出仪中进行体外释放实验，释放10 h，转速为（50 ±2）r／min，温度为（37±0.5）℃。其中，在预定的时间间隔内取样5 mL，并立即补充等量新鲜释放介质。用紫外分光光度计在305 nm处测定所取样液的吸光度，根据标准曲线方程（y＝103.01x+0.018 9，R2＝0.999 1，在0.085～17 mg／L范围内拟合效果较好）计算白藜芦醇的浓度，并分别计算样品中白藜芦醇的累积释放百分率。

式中：Xt为第t次累积释放率；V0为每次取样体积；Ve为释放介质总体积；Ct为第t次取出的缓释介质中白藜芦醇的浓度，g／L；m为样品中白藜芦醇的含量。

药物从载体材料中的释放过程主要是由扩散控制和降解溶蚀控制两种机制单独作用或共同作用的［18］。经典释药动力学模型包括零级释放动力学、一级释放动力学、Higuchi平面扩散动力学和Ketger-Peppas（KP）［112］释放动力学模型分别为：

式中：t为释放时间；Xt为在t时药物累积释放率；A、k为释放常数；X0为药物的初始浓度；X∞为最大累积释放百分数；n为释放指数，无量纲。

2 结果与讨论

2.1 样品载药率的测定与形貌表征

通过测定得到紫胶铵盐／白藜芦醇和紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇的载药率分别为7.91%和8.37%，表明紫胶铵盐对白藜芦醇具有良好的包覆能力，且加入His之后白藜芦醇的负载率略有提高。图1（a）所示为纯白藜芦醇的扫描电镜分析，白藜芦醇大多为细长的无规则晶体结构，粒径为（3 034.06 ±584.71）nm，粒径较大且不均匀。图1（b）中紫胶铵盐／白藜芦醇的形貌较规整，大多为表面光滑的球体结构，粒径为（838.83 ±154.24）nm，分布较为均匀。图1（c）中紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇形貌也呈表面较为光滑的球体结构，粒径为（898.08 ±173.62）nm，略大于紫胶铵盐／白藜芦醇的粒径。利用静电纺丝技术可以制备出白藜芦醇负载率高、形貌可控的固体分散体，且加入组氨酸材料后制备的紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇固体分散体的粒径呈现出略微增大的趋势。

图1 样品扫描电镜分析

2.2 傅里叶变换红外光谱分析

利用傅里叶变换红外光谱对样品的结构进行表征。由图2 可知，白藜芦醇红外光谱图中3 217 cm-1处为苯环—OH的伸缩振动吸收峰，1 585、1 515 cm-1处为芳环上的C ＝C伸缩振动吸收峰，1 153 cm-1处为C—O伸缩振动吸收峰，962 cm-1处为RCH ＝RCH 特征吸收峰。组氨酸红外光谱图中3 300～2 500、920 cm-1处为—COOH特征吸收峰，1 635 cm-1处为C ＝N伸缩振动吸收峰，835、683 cm-1处为C ＝C 键特征吸收峰［19-20］。紫胶铵盐／白藜芦醇红外光谱图中，1 515 cm-1处保留了白藜芦醇的C ＝C 特征吸收峰，且在2 931 cm-1处C—H特征吸收峰略有加强，表明白藜芦醇被成功包埋于紫胶铵盐中。紫胶铵盐-聚组氨酸／白藜芦醇的红外光谱图与紫胶铵盐／白藜芦醇基本一致，表明少量聚组氨酸的加入对固体分散体的结构没有明显的影响。同时，静电纺丝制备的紫胶铵盐／白藜芦醇和紫胶铵盐-聚组氨酸／白藜芦醇固体分散体的红外光谱图中未出现新的特征吸收峰，表明其制备过程不涉及化学反应。

图2 样品红外光谱分析结果

2.3 差示扫描量热分析

利用差示扫描量热仪对样品中白藜芦醇的分散状态以及载体的热稳定性进行表征。由图3 可知，纯白藜芦醇在269.8 ℃附近呈现出较强的吸热峰，而L-组氨酸在287.5 ℃处有尖锐吸热峰，这与它们本身的热分解温度相对应。静电纺丝制备的固体分散体紫胶铵盐／白藜芦醇与紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇没有出现明显的吸热峰，表明固体分散体的热力学性质更趋稳定，且白藜芦醇在固体分散体中以非晶体的形式存在，非晶态形式的药物其溶解度较高，易于吸收［21］。

图3 样品差示扫描量热分析结果

2.4 体外释放效果及其动力学

人体对药物、食物等的消化和吸收主要集中在小肠［22］。通过测定药物在体外胃肠消化模型中的释放效果，可以初步判断药物的释放规律。由图4 可知，在pH为6.8 的模拟肠液条件下，紫胶铵盐／白藜芦醇和紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇固体分散体中白藜芦醇释放过程可以大致分为3 个阶段，0～4 h 内为快速释放阶段，4～8 h内为持续缓释阶段，8 h 后为平稳释放阶段。10 h内紫胶铵盐／白藜芦醇和紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇中白藜芦醇的累积释放率分别为65.79%和81.54%，而纯白藜芦醇在10 h 内的累积释放率仅为52.24%。紫胶及其衍生物常作为肠溶药物的包衣材料，因此利用紫胶铵盐包覆白藜芦醇制备的紫胶铵盐／白藜芦醇固体分散体在pH ＝6.8 的模拟肠液中的累积释放率较高，表现出一定的肠溶特性。而加入L-组氨酸后制备的紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇中由于L-组氨酸的存在，其既可作为质子供体，又可作为质子受体［16］，使紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇在模拟肠液中能快速稳定释放出白藜芦醇，表现出优良的肠溶特性，有利于白藜芦醇在肠道中的释放与被吸收。

图4 pH ＝6.8条件下的体外释放效果

对白藜芦醇、紫胶铵盐／白藜芦醇和紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇在pH ＝6.8 的模拟肠液中的释放数据进行拟合，结果见图5 和表1。纯白藜芦醇的释放过程符合Higuchi释放动力学模型，属于简单的Fick 扩散释放。紫胶铵盐／白藜芦醇与紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇的释放过程均符合一级释放动力学模型，属于药物扩散和骨架溶蚀共同协助释放机制［18］。加入L-组氨酸之后，紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇的拟合方程中释放常数k值明显大于紫胶铵盐／白藜芦醇的释放常数k值，表明紫胶铵盐-组氨酸／白藜芦醇中白藜芦醇在模拟肠液中的释放速率更快。

表1 体外释放动力学拟合结果

图5 体外释放动力学模型拟合

3 教学特色与效果

本实验以培养学生综合运用专业基础理论知识创新性的解决实际问题的能力为目的，结合教师自身科研课题，以特色林源活性成分白藜芦醇为研究对象，从药物制剂学的角度设计了静电纺丝制备白藜芦醇固体分散体及其释药机制综合实验，实验内容涉及林产化学、天然药物化学、药物制剂学、材料科学、检测技术、数据处理等多门学科，学生在实验过程中不仅可以在教师指导下完成大型仪器设备的操作，还能学会使用Origin、SPSS等数据处理软件，有助于提高学生的科研能力，也促进学生对多学科交叉融合解决科研与生产实践问题的理解。

同时，本实验操作简便易行，具有一定的综合性与创新性，可在化学工程与工艺、制药工程等专业推广运用。针对专业和课程学时设置的不同，还可以对药物模型、制备技术等进行调整，例如，针对制备技术，可以将静电纺丝技术改为更易于实现的喷雾干燥、冷冻干燥等技术。

另外，根据课程思政建设的需要，可以充分挖掘并针对性地设置一些课程思政元素，培育本专业大学生正确的哲学观、世界观和科学观等。例如，介绍林产化学的发展史及我国重要林业科学家梁希等的科学贡献；阐述“绿水青山就是金山银山”理论及林产化学发挥的重要作用；林源活性成分大多作为初级产品供出口，而国外通过精深加工后制成的高附加值产品返销国内，我国实现资源优势与技术优势、产品优势的有机结合的重要性；分析检测技术的发展及当前我国在分析科学领域中面临的“卡脖子”的严峻形势与自主创新发展的重要性等，通过引入上述思政元素，有利于提高学生的思辨能力，培养学生的创新思维，提高学生对本专业的认同感和归属感。

4 结语

基于天然药物化学和药物制剂学等专业基础知识，设计了静电纺丝法制备白藜芦醇固体分散体及释药机制的综合实验。借助扫描电镜、傅里叶红外光谱和差示扫描量热等材料学表征技术，学生们对加入L-组氨酸前后制备的白藜芦醇固体分散体的理化性质进行了比较分析，并深入探究了固体分散体的释药效果与机理，通过实验教学的开展加深了学生对林产化学、天然药物化学、药物制剂学和仪器分析科学等相关专业基础知识的理解，知行合一，提高了学生利用专业知识与技能解决科学研究与生产实践问题的能力，有利于培养符合“新工科”要求的卓越创新人才。