乳酸乳球菌发酵复方中药对乌鳢生长和肠道炎性损伤指标的影响

2022-09-01陈秀梅邹记兴孔祎頔李若铭田佳鑫李金长生王桂芹

饲料工业 2022年16期

■陈秀梅邹记兴孔祎頔李若铭田佳鑫李金长生王桂芹*

（1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林省动物营养与饲料科学重点实验室，动物生产及产品质量安全教育部重点实验室，吉林长春 130118；2.华南农业大学海洋学院，广东广州 510642）

乌鳢（Channa argus），名优淡水养殖品种，深受消费者青睐，也是我国“十四五”特色淡水养殖品种之一[1-2]。在池塘集约化养殖模式下，由于养殖密度过大，以及过多投喂高蛋白饲料时，极易造成乌鳢养殖环境恶化，肠道压力过大，出现肠道炎性损伤，并发各种疾病，进而影响乌鳢养殖效益[1,3]。为了解决这一问题，一些水产养殖从业人员大量使用、甚至滥用抗生素和化学药物，这些药物在污染环境、破坏生态的同时，对食品安全问题也产生了不良影响[4]。因此在“禁抗”“替抗”大趋势下，通过饲料途径开发新型绿色添加剂改善乌鳢肠道健康是当前亟需考虑的。中药作为饲料添加剂的重要成员，具有纯天然、无毒害、无药残、安全方便、功能全面等优点，是近年来的研究热点[5]。作为中药炮制的一种重要方法，中药发酵将两者有机地结合起来，通过益生菌的酶解作用，不仅增加了中药活性成分的释放量，同时益生菌的一些代谢产物也可改变中药活性成分，达到增强药效的目的，具有广阔的应用前景[6-7]。但发酵中药作为近几年新兴的产业，在鱼类养殖中应用较少。因此，本试验以乌鳢为研究对象，探究了乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）发酵复方中草药对乌鳢生长和肠道炎性损伤指标的影响，旨在为开发新型的乌鳢功能饲料添加剂，为我国水产养殖探索一条替抗新道路，推动水产养殖向绿色安全的现代渔业发展。

1 材料与方法

1.1 试验鱼

乌鳢幼鱼，同一批次，体表无伤、游动活泼，在试验前先暂养15 d使其适应试验养殖环境。

1.2 试验菌、中药及饲料

试验用乌鳢源乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）L19（MT102746.1）、乌鳢源嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）W12由吉林农业大学预防兽医实验室提供。

试验用黄芩、黄柏、大黄、大青叶、甘草购自长春福百草大药房，65 ℃的烘箱中烘干，粉碎后过80 目筛，按比例混合为复方中药，保存备用。准确称取复方中药10 g，置于含100 mL 纯化水的250 mL 三角瓶中，121 ℃灭菌30 min，冷却至室温，将乳酸乳球菌（2%接种量，活菌数为1×108CFU/mL）接种至中药复方中，37 ℃振荡发酵24 h（前期试验优化后条件）。按0.5%的药量均匀喷洒于基础饲料中，在25 ℃空调房晾干，制成乳酸乳球菌发酵复方中药添加组饲料，每3 d 制备一批，保存在自封袋中4 ℃冷藏。基础饲料组成及营养水平见表1。

表1 试验饲料配方及营养水平（干物质基础）

1.3 试验设计及日常管理

暂养15 d 后，挑选身体健康、体型及规格一致的乌鳢360 尾，随机分成4 组，每组3 个重复，每个重复30尾，1组为对照组，先用0.1 mL PBS缓冲液肛灌处理后投喂基础饲料；2组先用0.1 mL PBS肛灌处理后投喂基础饲料+0.5%乳酸乳球菌发酵复方中药；3 组先用0.1 mL 1.0×106CFU/mL 嗜水气单胞菌肛灌处理后再投喂基础饲料；4组先用0.1 mL 1.0×106CFU/mL嗜水气单胞菌肛灌处理后再投喂基础饲料+0.5%乳酸乳球菌发酵复方中药。养殖8周。养殖期间日常管理及水质条件同暂养期间保持一致，水温23～25 ℃，溶解氧大于5 mg/L，pH（7.1±0.1）。每日饱食投喂两次（9：00，16：00），1 h后检查水族箱内残饵情况，用虹吸法吸出沉积残饵，并根据残饵量调整投喂量。

1.4 样品收集和指标测定

饲养试验进行8 周后，准备进行取样，取样前停食24 h，记录鱼的尾数，逐一测量体重，尾静脉抽血取血清，冰上解剖取肠道，-80 ℃冰箱保存待测。

根据记录的乌鳢初重、末重，按照常规计算公式计算平均增重率、饲料效率。

乌鳢血清D-乳酸、补体C3（C3）、溶菌酶（LZM）以及肠道Na+K+-ATP 酶、髓过氧化酶（MPO）、碱性磷酸酶（AKP）活性均采用南京建成生物技术研究所有限公司试剂盒检测，按照说明书进行操作。

乌鳢肠道促炎细胞因子[白细胞介素1β（IL-1β）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）]mRNA表达水平采用荧光定量PCR法检测，引物序列见表2。

表2 引物序列

1.5 数据统计

所有数据记录在Excel 表格中，利用SPSS（20.0）软件对数据进行单因素分析各个试验组间的差异显著性（显著水平设定P＜0.05），根据分析结果，所有试验数据采用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 乳酸乳球菌发酵复方中药对乌鳢生长的影响（见表3）

由表3 可知，与对照组相比，乳酸乳球菌发酵复方中药添加显著提高乌鳢的末重、平均增重率和饲料效率（P＜0.05），嗜水气单胞菌肛灌处理组乌鳢的末重、平均增重率和饲料效率显著下调（P＜0.05），乳酸乳球菌发酵复方中药添加则能回调乌鳢的末重和饲料效率，与对照组差异不显著。

2.2 乳酸乳球菌发酵复方中药对乌鳢肠道炎性损伤指标的影响（见表4、图1）

表4 乳酸乳球菌发酵复方中药对乌鳢炎性损伤指标的影响

由表4可知，与对照组相比，乳酸乳球菌发酵复方中药添加显著降低乌鳢肠道Na+K+-ATP酶和MPO的活性（P＜0.05），显著提高血清C3 水平和LZM 水平（P＜0.05），血清D-乳酸水平和肠道碱AKP活性有下降的趋势，但差异不显著。嗜水气单胞菌肛灌处理组乌鳢血清D-乳酸水平、C3水平和LZM水平及肠道Na+K+-ATP酶和MPO的活性显著上调（P＜0.05），肠道AKP活性有上升的趋势，但差异不显著（P＞0.05）。嗜水气单胞菌肛灌处理+乳酸乳球菌发酵复方中药添加组乌鳢血清D-乳酸水平及肠道Na+K+-ATP酶、AKP和MPO活性与对照组差异不显著（P＞0.05），但血清C3水平和LZM水平上升，与乳酸乳球菌发酵复方中药添加组差异不显著。

由图1 可知，与对照组相比，乳酸乳球菌发酵复方中药添加显著降低乌鳢肠道IL-1βmRNA 表达水平（P＜0.05），TNF-αmRNA 表达水平有下降的趋势，但差异不显著；嗜水气单胞菌肛灌处理组乌鳢肠道IL-1β和TNF-αmRNA 表达水平显著上调（P＜0.05）；嗜水气单胞菌肛灌处理+乳酸乳球菌发酵复方中药添加组乌鳢肠道IL-1β和TNF-αmRNA 表达水平下降，IL-1βmRNA表达水平与对照组差异不显著，但TNFαmRNA表达水平仍显著高于对照组（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 乳酸乳球菌发酵复方中药对乌鳢生长的影响

众多周知，肠道是鱼类消化吸收营养物质的重要器官，其消化、吸收能力与鱼类的生长休戚相关[8-9]。本试验条件下，嗜水气单胞菌肛灌处理就显著降低了乌鳢的末重、平均增重率和饲料效率。这是因为肠道是病原菌的主要入侵点之一，一旦病原菌大量感染，就会造成不同程度的损伤，影响正常消化吸收功能，进而抑制生长。类似的报道有很多，如在牙鲆（Paralichthys olivaceus）上的研究发现，鳗弧菌（Vibrio anguillarum）感染后肠黏膜和肠绒毛顶端出现脱落现象[10]。拟态弧菌（Vibrio mimicus）感染黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）后，16 h 出现肠绒毛水肿，24～48 h可见肠上皮变性与灶性坏死[11]。同样，嗜水气单胞菌被报道可致使岩源鲤（Procypris rabaudi）肠道扩张，充满黏液[12]。以上研究均表明病原菌的感染可破坏肠道组织结构的完整性，如何改善这一局面是当前亟需解决的问题。近年来益生菌发酵中草药引起众多学者的关注，这是因为中草药在抑菌方面有很好的疗效[13-15]，而益生菌在颉颃致病菌方面也有广阔的发展前景[16-18]，两者有机结合，不仅能够抑制病原菌的侵袭，还能够释放更多的活性物质改善肠道健康[19]。本试验条件下的结果就证明这点，即乳酸乳球菌发酵复方中药添加不仅促进健康乌鳢的生长，同样也改善了嗜水气单胞菌肛灌带来的生长抑制。类似的结果也出现在对其他鱼的研究上，赵倩等[20]研究发现饲料中添加2‰、3‰的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵中药能显著提高鲤鱼（Cyprinus carpio）的生长性能及抗嗜水气单胞菌感染能力。戴旭平等[21]报道添加5‰～10‰枯草芽孢杆菌和粪肠球菌（Enterococcus faecalis）发酵黄芪可有效提高杂交鲟（Acipenser schrenckii♀×Acipenser baerii♂）应对链球菌菌液浸泡感染的成活率。李永娟等[22]研究结果也证明了饲料中添加发酵中草药提高草鱼（Ctenopharyngodon idella）抗嗜水气单胞菌能力。由此可见，益生菌发酵中草药在促进鱼体生长和抗病力方面有很好的效果。

3.2 乳酸乳球菌发酵复方中药对乌鳢肠道炎性损伤指标的影响

肠道不仅是消化器官，还负责保护宿主免受各种毒素和病原体的侵害，在屏障功能方面也发挥巨大的作用[23]。肠道屏障主要由生物屏障、化学屏障、机械屏障和免疫屏障组成，一旦受损其通透性增加就会诱发多种疾病，且大多伴随着炎症反应[24]。尤其是病原菌入侵极易诱发肠道炎性损伤，已有研究证明嗜水气单胞菌可诱导草鱼肠道炎症[25]。评价肠道炎性损伤的指标有很多，一般选用通透性指标、免疫相关指标以及促炎细胞因子[26]。这是因为肠黏膜通透性增大，肠道中细菌生成的D-乳酸通过受损黏膜进入血液，导致血液中的D-乳酸水平迅速上升[27]。Na+K+-ATP酶是调节细胞渗透的代谢酶，可为营养物质的吸收提供动力[28]。C3、LZM和MPO作为机体非特异性免疫的作用分子，在防御外来微生物入侵中着扮演重要角色[29-31]。炎症反应常由细胞因子介导，IL-1β和TNF-α一般被认定为促炎因子，可启动机体免疫反应[32]。本试验条件下，嗜水气单胞菌肛灌也对乌鳢肠道屏障造成了损伤，通透性增加，表现在血清D-乳酸水平显著上升，肠道Na+K+-ATP酶活性显著上升。同时，激活肠道免疫系统，血清C3和LZM水平和肠道MPO活性显著上升，肠道AKP活性也有上升的趋势。而且最终造成了炎性损伤，即肠道IL-1β和TNF-αmRNA表达水平显著上调。乳酸乳球菌发酵复方中药添加则改善这种现象，本身不仅显著降低Na+K+-ATP 酶和MPO 活性，还提升血清C3 和LZM水平，改善上述嗜水气单胞菌肛灌带来的炎性损伤，进一步激活免疫系统，进而维持肠道的健康。谢炎福[33]研究结果表明发酵中药对嗜水气单胞菌引起的鲫鱼（Carassius auratus）出血病有明显的预防和治疗作用。谭晓晨等[34]对团头鲂（Megalobrama amblycephala）的研究报道也发现，添加4%以黄芪为主的中草药复方制剂可显著提高血清中溶菌酶活性，且嗜水气单胞菌攻毒后死亡率显著下降。尽管益生菌发酵复方中草药在改善肠道炎性损伤方面表现出巨大的潜力，但目前缺乏益生菌发酵中草药改善鱼类具体调控肠道健康的报道，还需更多的学者进行深入研究。