角鲨烯对断奶仔猪肠道发育、抗氧化能力及肠道菌群的影响

2022-09-01张国慧郭晓淼纪志诚谭晓彤周业勋张丹丹

饲料工业 2022年16期

■高阳张国慧郭晓淼纪志诚谭晓彤杜鑫周业勋张丹丹*

（1.白城师范学院生命科学学院，吉林白城 137000；2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，动物营养学国家重点实验室，北京 100193）

现今，在集约化、规模化的养猪模式中，仔猪断奶日龄逐渐提前，这既能加快猪场的周转率，还能提高母猪的利用率[1]。然而，断奶日龄的提前会给仔猪带来严重的应激反应。断奶后环境变化与肠道生理负担严重影响了仔猪的生长性能，继而影响猪场经济效益[2]。众所周知，肠道在仔猪的消化系统中扮演重要角色，发育健全的肠道功能不仅为消化酶提供适宜的催化场所，还为肠道菌群提供良好的定植环境[3]。因此，在“全面禁抗”的大环境下，寻求新型、高效的饲料添加剂，改善断奶仔猪肠道发育对养猪产业具有十分重要的现实意义。

角鲨烯是一种天然不饱和三萜，广泛存在于动物肝脏和皮肤中。1916年，日本学者在鲨鱼肝脏中提取出角鲨烯。最初，角鲨烯多用于皮肤表面单态氧的清除和改善心脏的缺氧耐受力。随后，体内试验进一步证明角鲨烯的佐剂安全性和饲用可行性。研究表明，角鲨烯对种公猪精液品质具有较好的改善作用[4]。Gabás-rivera等[5]研究表明，补饲角鲨烯可增加小鼠血清中高密度脂蛋白和对氧磷酶-1的水平，并缓解小鼠的氧化应激损伤。也有研究指出角鲨烯能改善罗斯鸡胸肌肉品质[6]。然而，角鲨烯作为畜禽饲料添加对断奶仔猪的效果很少有报道。众所周知，肠道健康关系着动物的生长性能和经济效益，健全的肠道屏障和肠道机能有利于维持肠道稳态和菌群定植。因此，本试验利用角鲨烯作为饲料添加剂，探究其对断奶仔猪肠道发育、肠道菌群及消化机能的影响，为角鲨烯在断奶仔猪生产中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

纯度约为92%的角鲨烯，宜春大海龟生命科学有限公司；抗氧化指标试剂盒，南京建成生物工程研究所有限公司；核酸提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光染料，天根生化科技有限公司；试验所需抗体，Abcam（上海）贸易有限公司。

1.2 试验动物分组与设计

试验选择24 头25 日龄的断奶三元杂交猪（杜×长×大），体重相近且均为去势雄性。试验采用单因子随机区组设计，将动物随机分为两个处理，每个处理6 个重复，每个重复2 头仔猪。A 组和B 组仔猪饲粮中角鲨烯添加水平分别为0 和250 mg/kg。预试期3 d，正试期25 d，所有仔猪自由饮水和采食，每日记录采食量和剩料量。饲养试验于2021 年7 月在吉林省四平市梨树市四棵树乡养殖合作社进行。

1.3 试验饲粮

基础日粮营养水平参考NRC（2012）和《动物营养参数及饲养标准》（2010版）[7-8]，基础日粮组成和营养水平见表1。

1.4 测定指标及方法

试验结束时，屠宰仔猪，打开仔猪腹腔收集空肠和回肠样本，每个肠段收集4份，1份置于4%多聚甲醛溶液中，其余3份液氮预冷，转置-80 ℃冰箱中。盲肠内容物收集在2 mL冻存管中，液氮预冷，转置-80 ℃冰箱中。

H.E.染色切片处理与分析参照沈梦城[9]的方法。将收集到的仔猪空肠和回肠样本置于4%多聚甲醛中固定48 h，设置Thermo Fisher Scientific 1000D型全自动脱水机Daytime Rapidly 程序，依次浸入60%、70%、75%、80%、95%和100%。置于二甲苯中透明后，浸泡于脱水系统的蜡液中，包埋。设置切片机参数，空肠厚度5.5 μm，回肠5 μm。经摊片烘干后，置于Thermo Fisher Scientific 24-4 型全自动切片染色机，按内置程序染色，中性树胶封片。使用Toupview（X86）软件对空肠和回肠绒毛高度和隐窝深度测量，并计算绒毛高度/隐窝深度值。

RT-PCR 中mRNA 提取、反转及IGF-1和GLP基因mRNA 相对表达量及IGF-1 和GLP 蛋白相对表达量的测定均参照Zhao 等[10]的方法。采用Primer Premier 6.0 软件进行PCR 引物设计，引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列见表2。

表2 引物序列

肠道胰蛋白酶（A080-2）、淀粉酶（C016-2）和脂肪酶（A054-1）的活性使用南京建成生物工程研究所有限公司试剂盒检测，按说明书步骤操作。

盲肠内容物微生物组成检测采用RT-PCR，具体方法参照温晓鹿等[11]的方法。采用（Tiangen公司）试剂盒提取盲肠内容物总细菌DNA，应用ND-1000型核酸分析仪检测DNA浓度，然后使用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度。将总细菌DNA分别与不同浓度的总细菌、大肠杆菌、双歧杆菌和乳酸杆菌的标准指令进行qPCR 检测，再通过标准质粒浓度与Ct值做回归分析，获得回归曲线，将样品Ct值代入回归方程计算得到目标菌属的DNA拷贝数，结果以每克盲肠内容物中细菌拷贝数的常用对数表示（单位：lg 拷贝数/g）。

1.5 统计分析

使用SPSS 22.0 软件中的one-way ANOVA 进行数据分析，采用LSD模块进行差异显著性检验，以P＜0.05 作为差异显著性判断标准，试验数据均以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。采用Origin pro 9.1 软件制图。

2 结果与分析

2.1 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道发育的影响（见表3、表4、图1、图2）

表3 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道发育的影响

表4 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道IGF-1和GLP蛋白相对表达量的影响

由表3 可知，饲粮添加250 mg/kg 角鲨烯可显著提高断奶仔猪空肠和回肠绒毛高度（P＜0.05），并降低隐窝深度，但差异不显著（P＞0.05）。此外，饲粮添加250 mg/kg角鲨烯，仔猪空肠、回肠绒毛高度/隐窝深度值显著升高（P＜0.05）。由图1 可知，饲粮添加角鲨烯可显著提高断奶仔猪空肠和回肠组织中IGF-1和GLP基因mRNA 相对表达量（P＜0.05）。由表4 和图2可知，角鲨烯可显著提高断奶仔猪空肠及回肠组织中IGF-1蛋白和GLP蛋白相对表达量（P＜0.05）。

图1 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道IGF-1和GLP基因mRNA相对表达量的影响

图2 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道IGF-1和GLP蛋白相对表达量的影响

2.2 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道消化酶活性的影响（见表5）

由表5可知，饲粮添加角鲨烯可显著提高空肠食糜中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性（P＜0.05）。饲粮添加角鲨烯能显著提高断奶仔猪回肠食糜中淀粉酶活性（P＜0.05），但是，饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪回肠食糜中胰蛋白酶和脂肪酶活性无显著影响（P＞0.05）。

表5 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道消化酶活性的影响（IU/mg）

2.3 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道抗氧化性能的影响（见表6）

由表6可知，饲粮添加角鲨烯可显著降低断奶仔猪空肠和回肠组织中MDA 含量（P＜0.05），同时显著提高仔猪空肠和回肠组织中SOD 与GSH-Px 的活性（P＜0.05）。

表6 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪肠道抗氧化性能的影响

2.4 饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪盲肠微生物组成的影响（见图3）

由图3可知，饲粮添加角鲨烯对断奶仔猪盲肠内容物总细菌数量无显著影响（P＞0.05）。饲粮添加角鲨烯能显著降低断奶仔猪盲肠内容物中大肠杆菌的数量（P＜0.05），同时显著提高乳酸杆菌和双歧杆菌的数量（P＜0.05）。

图3 角鲨烯对断奶仔猪盲肠微生物组成的影响

3 讨论

近年来，断奶仔猪的肠道发育状态得到了广泛关注与研究。一般认为，仔猪的肠道在42～45 d 发育健全，而仔猪的断奶多为21～35 d[12-13]。研究表明，断奶后，仔猪肠道的应激损伤会加速肠上皮细胞凋亡，阻碍肠道发育，对仔猪的免疫和消化功能也产生严重影响[14-15]。因此，仔猪快速度过断奶应激并完成肠道发育，对其健康生长具有重要的意义。角鲨烯具有机体抗氧化、抗炎、免疫调节和心血管保护等功能[16]。研究表明，饲粮添加125～250 mg/kg 角鲨烯能够改善早期断奶仔猪生长性能和抗氧化性能，促进空肠绒毛生长[17]。该试验结果表明，饲粮添加角鲨烯能显著提高断奶仔猪空肠和回肠VH 和VCR，同时显著提高空肠组织中IGF-1和GLP基因相对表达量及IGF-1和GLP蛋白的相对表达量。GLP-2 蛋白通过调控蛋白质合成速率，促进肠道细胞增殖并抑制细胞凋亡，防止肠黏膜萎缩[18]。此外，GLP 蛋白可以刺激肠道上皮成纤维细胞产生IGF-1，IGF-1可以诱导隐窝的增殖、绒毛的伸长和肠道屏障功能的完整性[19]。在上述过程中，得益于角鲨烯良好的流动性，使其可以在肠道上皮均匀分布，发挥抗炎及抑菌作用，为空肠和回肠绒毛的发育提供有利条件。

众所周知，肠道消化酶的活性受多种因素制约（如动物年龄、肠道稳态、生理阶段和健康状况等）。一般认为，发育良好的肠道结构有利于发挥消化酶的高效性。一方面，良好肠道屏障和肠道稳态能为消化酶提供反应场所；另一方面，健康的肠道环境有利营养物质进入循环系统。该研究中，饲粮添加角鲨烯显著提高断奶仔猪空肠食糜中胰蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，并有效改善空肠中上述消化酶活性。已有研究表明，早期断奶仔猪饲粮中添加角鲨烯能促进空肠绒毛生长，降低空肠隐窝深度并改善空肠黏膜层通透性[17]。此外，角鲨烯在改善肠道紧密连接蛋白表达量方面也发挥重要作用。因此，可初步认为角鲨烯可能在维持肠道结构与功能稳定性中扮演重要角色，继而改善空肠与回肠中消化酶的活性。

饲粮的改变是导致断奶仔猪肠道应激的重要因素之一，仔猪的营养源从母乳变为植物性饲料，饲粮中的纤维虽能促进肠道的发育，但更容易造成绒毛受损，导致肠细胞抗氧化性能降低和肠屏障通透性增大，进而影响肠道的发育及功能[20]。研究表明，肉鸡和大鼠补饲角鲨烯能显著降低血清、肝脏和肌肉组织中的MDA 水平，并提高SOD、GSH-Px 和CAT 等抗氧化酶活性[6,21-22]。该研究表明，饲粮添加250 mg/kg 角鲨烯能显著提高断奶仔猪空肠、回肠组织中SOD 和GSH-Px活性，并降低MDA含量。其原因可能有两方面；一方面角鲨烯自身具备良好的单态氧清除能力，在清除自由基和超氧阴离子的同时，调控机体多种抗氧化酶的活性，二者协同作用改善仔猪肠道抗氧化机能；另一方面，角鲨烯通过维持三羧酸循环酶和呼吸标记酶活性，改善能量状态并增强线粒体的抗氧化能力。

正常情况下，仔猪的肠道菌群结构处于动态平衡，有益菌群和有害菌群相互博弈，共同影响宿主的健康状态[11]。然而，断奶应激会打破仔猪肠道中原有的微生物稳态，进而导致腹泻、消化酶活性降低和采食量降低等问题[23]。该研究中，饲粮添加角鲨烯可显著降低仔猪盲肠内容物中大肠杆菌数量，并提高乳酸杆菌和双歧杆菌数量。其原因可能是角鲨烯在维持肠道结构中发挥重要作用。良好的肠道结构为益生菌的定植提供条件，进而竞争性抑制有害菌的增殖，维持动物肠道菌群结构稳态，有利于肠道发育和动物生长。