口服α-硫辛酸对MPTP-PD模型老年小鼠的保护作用*

杨晓波，姚 恺，祖恒兵，赵永飞

（复旦大学附属金山医院神经内科，上海 201508）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是老年人常见的神经退行性疾病。流行病学研究证实衰老是散发性PD最重要的独立危险因素［1］。随着人类平均寿命的不断延长和人口老龄化不断加剧，衰老相关疾病日益成为一个紧迫的问题。

PD 主要由黑质致密部多巴胺能（dopaminergic，DA）神经元严重丢失引起。氧化应激和自由基损伤被认为是衰老发生和PD 发病的重要关联原因［2］。PD 中存在易于导致DA 神经元死亡的物质，如功能障碍的溶酶体和泛素蛋白酶体标志物、氧化应激标志物等，这些物质在正常衰老过程中以区域特异性模式蓄积（如中枢神经系统），最终可促进PD 的发生。同时，自然衰老过程中，中枢神经系统抗氧化应激损害能力逐渐减弱，也增加了患PD 的风险。因此，抗氧化应激反应有可能对延缓衰老进展有一定的效果。根据散发性PD 二次打击发病理论［3］，延缓衰老进展可能在PD 防治过程中减轻第一次打击的损伤，从而影响二次打击后PD的发生。

α-硫辛酸（α-lipoic acid，α-LA）是机体在线粒体内能自身合成的化合物，可作为辅酶参与物质代谢中的酰基转移，能消除导致加速老化与致病的自由基，通过多种机制参与抗氧化。研究表明，大鼠PD模型中，α-LA 处理可有效保护黑质纹状体DA 神经元［4-5］，但既往的研究主要集中于注射给药，对于口服给药模式缺乏研究，同时对相关作用机制也尚未完全阐明。1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶（1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine，MPTP）能诱导经典的氧化应激损伤PD 模型，因此本研究选用MPTP 诱导的老年小鼠PD 模型，探讨口服α-LA 是否在衰老和PD的发生发展起一定的预防作用。

材料与方法

1 材料

1.1 实验动物 老年健康雌性C57/BL6 小鼠在8～10周龄时购自中国科学院上海分院实验动物中心上海斯莱克实验动物有限公司，置于（25±2）℃环境下，清洁级饲养，自由进食及饮水。饲养至16 月龄时随机分组，18 月龄时实验干预结束后处死，体重33～38 g。动物饲养和实验设计均符合复旦大学伦理委员会要求。

1.2 主要试剂 α-LA 和MPTP 购自Sigma；RIPA 裂解液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物公司；兔抗小鼠酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase，TH）抗体购自Millipore；兔抗小鼠血红素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）抗体购自Abgent；兔抗小鼠核因子E2 相关因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）抗 体、兔抗小 鼠NADPH 氧化酶2（NADPH oxidase 2，NOX2/gp91phox）抗体及兔抗小鼠GAPDH（内参照）抗体购自Abcam；山羊抗兔Ⅱ抗IgG-HRP 及荧光Ⅱ抗购自Invitrogen；ECL 化学发光试剂购自Millipore。

2 方法

2.1 建立小鼠氧化应激损伤PD 模型 C57/BL6 老年小鼠32 只，随机分为老年MPTP 组、老年LA+MPTP 组、老年对照组和老年LA 组，每组8 只。老年LA+MPTP 组和老年LA 组在16月龄时将日常饮用水换成0.5 g/L 的α-LA 溶液，每天自由饮用，平均每只饮用5 mL/d。老年MPTP 组和老年LA+MPTP 组在出生18 个月时，MPTP 剂量第1、2 天为20 mg/（kg·d），第3～5 天为25 mg/（kg·d），用生理盐水稀释，每次200µL 腹腔注射，每天1 次，共5 d；老年对照组和老年LA 组腹腔注射等体积的生理盐水。首次注射后10 d，行为学检测之后处死动物，30 s内快速取脑，每组4只固定后用于免疫荧光染色，其余4只去除小脑部位，用于蛋白定量检测，-80 ℃保存。

2.2 转棒（rotarod）实验 小鼠行为学检测采用rotarod 实验，在MPTP 腹腔注射后第2天开始。待测试小鼠安放于转棒踏车（Ugo Basile）上，从4 r/min 的初速开始，在3 min 内逐渐加速到40 r/min 的速度。计数每次从开始计数到从转棒踏车上坠落的时间。检测前2 d开始行为训练和学习，每天训练一次。检测每日进行一次，连续检测4 d。

2.3 脑组织蛋白提取 取各组小鼠4 只，用10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉后开胸，经左心室先灌注温的生理盐水至肝脏颜色变白后，快速分离脑组织并称量，置1.5 mL 离心管中，加入RIPA 裂解液，在冰上用匀浆器将组织匀浆。冰上充分裂解1 h，匀浆置4 ℃、12 000×g离心30 min，吸取上清液，弃沉淀，转移至新预冷的微量离心管中。按BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白浓度。

2.4 Western blot 将脑组织蛋白样本与上样缓冲液以4∶1 比例混合，100 ℃加热5 min，每组标本上样蛋白量为10 µg，进行SDS-PAGE 分离，200 mA 恒定电流下室温电转膜2 h；1×TBST 液洗膜，室温下5%脱脂奶粉封闭液封闭2 h；分别将兔抗小鼠TH 抗体（1∶2 000）、兔抗小鼠Nrf2 抗体（1∶1000）、兔抗小鼠HO-1 抗体（1∶1 000）、兔抗小鼠NOX2/gp91phox抗体（1∶1 000）及兔抗小鼠GAPDH 抗体（1∶8000）4 ℃孵育过夜。1×TBST 洗膜10 min×3 次，加二抗山羊抗兔IgG-HRP，室温孵育1 h，1×TBST 洗膜10 min×3 次；采用ECL 化学发光法置Bio-Rad 自动曝光仪中进行显色曝光。图像处理及分析：由Bio-Rad 自动曝光仪自带的分析软件Image Lab 完成。TH、Nrf2、HO-1 和NOX2/gp91phox相对表达量以目标蛋白与内参照吸光度的比值表示。

2.5 免疫组织荧光 取各组小鼠4 只麻醉后开胸，经左心室灌注温的生理盐水至肝脏颜色变白后，用4%多聚甲醛经心脏灌注内固定，分离脑组织，置10%～30%蔗糖溶液梯次脱水，OCT 包埋，液氮冰冻，LEICA 冰冻切片机切片（层厚10µm）。选取脑黑质及纹状体区组织标本切片室温充分干燥，PBS 洗5 min×3 次，5%小牛血清室温下封闭30 min，切片分别滴加兔抗小鼠TH 抗体（1∶500）、兔抗小鼠Nrf2 抗体（1∶50）、兔抗小鼠HO-1 抗体（1∶50）、兔抗小鼠gp91phox抗体（1∶50）及大鼠抗小鼠CD11b 抗体（1∶50）；4 ℃孵育24 h 后PBS 洗5 min×3 次，滴加Fluor-555 山羊抗兔IgG（1∶1 000）或Fluor-488 山羊抗大鼠IgG（1∶1 000），室温作用1 h。PBS 洗5 min×3 次，切片滴加Hochest 33342（1∶1 000），室温孵育5min，PBS洗5 min×3 次，50%甘油封片。置Olympus 荧光显微镜下观察，Image-Pro Plus 6.0 软件分析免疫荧光图像，计数黑质和纹状体区免疫阳性细胞或表达相应蛋白的小胶质细胞。

2.6 统计学分析 采用GraphPad Prism 6 软件进行数据统计处理。数据以均数±标准差（mean±SD）表示，组间均数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

1 α-LA对老年小鼠行为学的影响

为了评估较长时期口服抗氧化剂α-LA 抗衰老（即减轻首次打击）的作用，以及是否能减轻二次打击后DA 神经元的丢失，我们用rotarod实验来评估各组小鼠的运动平衡和协调功能，从在转棒上记时开始到从转棒上跌落，时间越长代表运动平衡和协调功能越好。结果显示，老年LA+MPTP 组在转棒仪上的运动时间与老年对照组和老年LA 组之间无显著差异（P＞0.05），而老年MPTP 组在转棒仪上的运动时间显著低于其余3 组（P＜0.05 或P＜0.01），见图1。实验结果提示，α-LA 较长时期口服干预可以改善运动平衡和协调功能，在一定程度上减轻老年MPTPPD小鼠的运动障碍。

Figutre 1.Results of rotarod test.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；LA：lipoic acid；CTRL：control.Mean±SD. n=8.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.图1 转棒实验

2 α-LA对老年小鼠脑内TH表达的影响

TH 是多巴胺合成的关键酶，而多巴胺减少是PD 主要发病机制之一，于是我们检测了α-LA 作用下各组小鼠脑内TH的表达。Western blot结果显示，老年MPTP 组的TH 表达量显著低于老年LA+MPTP组（P＜0.05），也显著低于老年对照组和老年LA 组（P＜0.01），见图2A。免疫荧光检测发现，老年小鼠黑质纹状体区TH 免疫反应阳性细胞稀疏，以黑质腹侧部（ventral part of substantia nigra，vtSN）最为显著。老年MPTP 组的TH 免疫反应阳性细胞丢失最明显，黑质各区都很少能见完整的TH 免疫反应阳性神经元，而老年LA+MPTP 组、老年对照组和老年LA 组在vtSN 和黑质背侧部（dorsal part of substantia nigra，dtSN）TH 免疫反应阳性细胞也大量丢失，但在腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）能见到一定数量完整的TH 免疫反应阳性神经元，见图2B。以上研究结果提示，长期口服α-LA 并没有显著减少正常衰老状态下的TH 神经元丢失；在MPTP-PD 模型组中，没有口服α-LA 的情况下，黑质区TH 神经元显著丢失；而长期口服α-LA 能很好地发挥抗氧化应激和自由基清除作用，从而保护TH 神经元免受MPTP 毒物损害造成的丢失。

3 α-LA 对老年小鼠脑内抗氧化应激蛋白Nrf2 和HO-1表达的影响

氧化应激是衰老和PD 的重要原因，我们检测α-LA 对氧化应激相关分子的影响。Western blot 实验结果显示，老年MPTP 组的Nrf2 表达显著低于老年LA+MPTP 组（P＜0.05），亦显著低于老年对照组和老年LA 组（P＜0.01），而老年对照组与老年LA 组之间差异无统计学显著性（P＞0.05）。免疫荧光结果与Western blot检测结果一致，黑质纹状体区老年MPTP组的Nrf2免疫反应阳性细胞数（29±5）显著低于老年LA+MPTP 组（57±6）、老年对照组（74±6）和老年LA组（96±11），差异均有统计学显著性（P＜0.05），老年对照组与老年LA 组之间差异无统计学显著性（P＞0.05）；我们通过CD11b 标记小胶质细胞，发现Nrf2免疫阳性荧光主要与CD11b 免疫阳性荧光共定位。HO-1 的实验 结果 与Nrf2 类 似，老 年MPTP-PD 组 的HO-1 表达显著下调，与老年LA+MPTP 组、老年对照组和老年LA 组相比均有显著差异（P＜0.05 或P＜0.01），老年对照组与老年LA组之间无显著差异（P＞0.05）。免疫荧光检测结果与Western blot 检测结果趋势相似，老年MPTP-PD组黑质纹状体区的HO-1免疫反应阳性细胞（17±3）显著低于老年LA+MPTP 组（43±8）、老年对照组（66±8）和老年LA 组（86±4），差异均有统计学显著性（P＜0.05），老年对照组与老年LA 组之间差异无统计学显著性（P＞0.05）。HO-1 免疫阳性荧光也主要与CD11b 免疫阳性荧光共定位。见图3。

Figure 2.Effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of tyrosine hydroxylase（TH）in the brain of aged mice.A：Western blot was used to detect TH expression；B：immunofluorescence showed TH immunoreactive neurons（scale bar=50µm）.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；CTRL：control；VTA：ventral tegmental area；dtSN：dorsal part of substantia nigra；vtSN：ventral part of substantia nigra.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.图2 α-硫辛酸对老年小鼠脑内酪氨酸羟化酶表达的影响

4 α-LA 对老年小鼠脑内氧化应激蛋白NOX2/gp91phox表达的影响

我们进一步检测了氧化应激相关的分子改变。Western blot 结果显示，老年MPTP 组的NOX2表达显著高于老年LA+MPTP 组（P＜0.05），也显著高于老年对照组和老年LA 组（P＜0.05），老年对照组与老年LA 组之间无显著差异（P＞0.05）。免疫荧光检测与Western blot 检测结果趋势相似，老年MPTP 组黑质纹状体区的NOX2 免疫反应阳性细胞（86±4）显著高于老年LA+MPTP 组（71±5），也显著高于老年对照组（62±4）和老年LA 组（45±6），差异均有统计学显著性（P＜0.05），老年对照组与老年LA组之间也有显著差异（P＜0.05）。NOX2 免疫阳性荧光主要与CD11b 免疫阳性荧光共定位。见图4。

以上实验结果提示，与正常老年对照组相比，长期口服抗氧化剂α-LA 未发现能显著改变正常衰老状态下氧化应激反应Nrf2/抗氧化反应原件信号通路中氧化和抗氧化信号因子的表达量，但在遭遇二次打击时（MPTP 毒物损害），氧化应激反应显著加剧时，α-LA 能很好地发挥清除自由基、抗氧化应激反应，保护神经元，显著减少TH 神经元的进一步丢失。我们还发现，小胶质细胞是氧化应激反应的主要参与者。

讨 论

衰老与PD 的发生密切相关，我们既往的研究也证明衰老是散发性PD 的促进因素之一［6］，而氧化应激损伤在其中扮演了重要角色［7］。自从发现MPP+通过抑制电子传递链复合物Ⅰ导致黑质神经元丢失引起帕金森症状群以来，线粒体功能异常、氧化应激对黑质内健康、存活的神经元的作用以及PD 发病机制的重要性的认识不断加深。随着年龄增长，功能缺陷的线粒体蓄积不断增加，线粒体产能过程受损，活性氧族生成增多，氧化应激损伤加重［8］，足以引起PD 相关的神经病理和症状，被认为是PD 发病的重要原因。同时，作为PD 发生机制的多巴胺的自身代谢可导致α-synuclein聚集［9］，加重氧化应激损害及神经元损害。过多的DA 氧化代谢的产物可直接导致线粒体功能障碍、引起氧化应激加重［10］。可见，线粒体功能障碍、氧化应激损伤可促进细胞衰老丢失，进一步促进PD的发生。

Figure 3.The effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of heme oxygenase-1（HO-1）and nuclear factor E2-related factor 2（Nrf2）and HO-1 in the brain of aged mice.A and B：Western blot analysis of HO-1 and Nrf2 expression；C and D：immunofluorescence showed HO-1 and Nrf2 immunoreactive positive cells（scale bar=50 µm）.MPTP：1-methyl-4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine；CTRL：control.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.图3 α-硫辛酸对老年小鼠脑内抗氧化应激蛋白Nrf2和HO-1表达的影响

Figure 4.Effect of α-lipoic acid（LA）on the expression of oxidative stress protein NOX2/gp91phox in the brain of aged mice.A：the expression of NOX2/gp91phox was detected by Western blot；B：immunofluorescence showed NOX2/gp91phox immunoreactive positive cells（scale bar=50µm）.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs aged MPTP group.图4 α-硫辛酸对老年小鼠脑内氧化应激蛋白NOX2/gp91phox表达的影响

α-LA 是一种在线粒体内可自然合成的小分子强力抗氧化剂，由辛酸衍生来的二硫化合物，是线粒体的能量代谢中一些脱氢酶所必需的辅因子［11］，它含有2 个氧化的或还原的巯基基团，其还原型称为二氢硫辛酸，是与ROS相互作用的主要形式，其氧化型通常称为硫辛酸，同样能清除自由基。α-LA 的作用机制较多，它可以直接螯合铁离子，参与其代谢，在PD 发生中起到保护作用［12］，也可以通过激活Nrf2信号通路减轻神经细胞死亡［13］。在中枢神经系统中，α-LA 可通过改变细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐的比例发挥抗氧化作用，此外，还原型α-LA 还能促进其它抗氧化剂如谷胱甘肽过氧化物酶的表达水平，增强这些抗氧化剂的作用效果［14］。鉴于线粒体功能障碍和氧化应激损伤是衰老和帕金森病共同的重要危险因素，而α-LA 具有自由基清除和抗氧化作用，补充α-LA 来抗衰老及抗PD 的研究已在人体和动物模型的多种器官中进行，研究最多的是耗氧量最大的脑和心脏组织［15-16］，如研究发现补充α-LA 可在一定程度上改善记忆［17］。

尽管既往的研究结果提示α-LA 能有效抗衰老，但具体机制仍不完全明确，其用药方式也多为腹腔注射，而无创性给药途径的效果尚缺乏评估。我们的研究结果发现，给予正常老龄小鼠每天口服α-LA，无论是行为学功能评价还是检测TH 表达量，或是检测黑质纹状体区TH 免疫反应阳性神经元数量，与对照组之间的差异并没有统计学显著性，与PD 发病密切相关的氧化应激平衡和抗氧化应激损害的Nrf2 氧化应激通路［18］中信号因子的表达也没有显著差异，提示在正常衰老状态下口服α-LA 对一般衰老状态的改善效果并不明显。我们推测，促进衰老是由多种因素和机制参与，氧化应激仅是其中之一，由于衰老机制的多样性，单一口服α-LA 的抗氧化应激作用还不能显著消除内源性氧化应激产生的影响，导致不能显著改善衰老及PD 相关的DA 神经元丢失及氧化应激反应增加。

但是，我们的研究发现，老年小鼠在受到MPTP毒物打击时，口服α-LA 能有效减轻MPTP 作用造成的伤害。转棒实验行为学测试发现老年α-LA+MPTP 组的运动协调平衡功能显著好于老年MPTP组，同时减缓了脑内TH 表达的下降和多巴胺能神经元的丢失。此外，已有文献报道α-LA 对Nrf2/HO-1通路具有激活作用［19-20］，是其抗氧化作用的机制之一，但在MPTP-PD 模型中尚未证实。我们研究发现，老年α-LA+MPTP 组中抗氧化应激防御分子Nrf2及其下游的保护性抗氧化因子HO-1 表达显著高于老年MPTP 组，而代表氧化应激反应严重度的NOX2表达显著低于老年MPTP 组，说明口服α-LA 还能够诱导Nrf2 氧化应激通路激活，维持脑内氧化应激平衡，从而起到保护作用，与以往研究结果相似［21］。

综上所述，α-LA 是一个有效的抗氧化剂和自由基清除剂，在正常生理性衰老状态下并没有显著的保护黑质纹状体区DA 神经元效果，但当遭受环境因素的2 次打击时，线粒体功能严重异常、自由基产生过度失衡，氧化应激损伤明显加重，超过了机体自身抗氧化能力，长期口服α-LA 能显著缓解氧化应激，减少黑质纹状体区DA 神经元的进一步丢失，具有一定的预防PD效果。