蒙古沙冬青AmRD22基因的克隆及耐逆功能研究

张 敏，王学峰，马 利，刘佳杰，张慧玲，王茅雁

(内蒙古农业大学 生命科学学院，呼和浩特 010018)

土壤盐渍化和干旱严重影响植物的生长发育和产量及品质，成为影响全球农业生产的主要非生物胁迫。植物在演化过程中形成了复杂的机制来应对这些逆境胁迫，其中耐逆基因的表达是形成复杂耐逆机制的遗传基础[1]。目前已从许多植物中鉴定出大量耐逆相关基因，其中脱水应答蛋白22(responsive to dehydration protein 22，RD22)类基因与植物的耐盐性和耐旱性密切相关，成为重要候选耐逆基因。

RD22s属于植物特有的BURP(取自最初4个成员BNM2、USP、RD22和PG1β的首字母)蛋白家族中的一个亚族[2]。至今已相继从拟南芥(Arabidopsisthaliana)、大豆(Glycinemax)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等许多植物中克隆或发现其编码基因[3-8]，并对部分基因的功能进行了研究。序列分析表明，大多数RD22蛋白从N端至C端由4部分组成，即短疏水区(多为信号肽)、短保守区、含TXV重复单元的可变区和长而保守的BURP结构域[3-5,9-11]，其中多数蛋白如大豆GmRD22、陆地棉(Gossypiumhirsutum)GhRDL1和拟南芥AtRD22等定位于细胞壁或质外体[9-11]，个别如咖啡(Coffeaarabica)CaBDP1定位于内质网[12]。

目前对于RD22类基因的生理功能所知不多。AtRD22的表达受脱水、盐胁迫和外源脱落酸(abscisic acid, ABA)诱导，此过程需ABA信号通路转录激活因子AtMYC2/rd22BP1和AtMYB2的合成与调节[3,13-14]，其突变体的耐旱性增强[15]。AtRD22还受Cu2+胁迫的诱导，其编码蛋白可与Cu2+结合并在抵抗Cu2+胁迫中起重要作用[16-17]。紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)Tard22、多枝柽柳(T.ramosissima)Trrd22和葡萄(Vitisvinifera)VvRD22a/VvRD22的表达受盐和/或干旱胁迫的诱导，转入烟草(Nicotianabenthamiana)可提高耐盐性和/或耐碱性[7,18-21]。大豆Gm06.2/GmRD22的启动子区含ABA应答元件ABRE(ABA responsive element)，其表达对ABA、盐和渗透胁迫有明显响应，转入拟南芥或水稻(Oryzasativa)可提高木质素含量和耐盐性及耐旱性[6,9]。咖啡CaBDP1的表达被干旱、盐和低温胁迫抑制而下调，但受ABA诱导，其转基因拟南芥的耐盐性降低、ABA敏感性增强[12]。其他RD22基因中有许多在干旱、盐和/或低温胁迫下表达量上调，其中又有多数基因，如油菜(Brassicanapus)BnBDC1、盐穗木(Halostachyscaspica)HcRd22和小麦(Triticumaestivum)TaBURP3D等的表达受外源ABA调节，可能通过依赖于ABA的信号途径发挥功能[4,22-23]，但它们在抵抗逆境和ABA胁迫中的具体作用未见报道。有少数RD22基因主要参与生长发育过程，如陆地棉GhRDL1/GhRD4在伸长的棉纤维细胞中高表达，其编码蛋白通过与细胞壁伸展蛋白GhEXPA1互作而使细胞壁松弛，从而促进转基因拟南芥和棉花的生长并使其明显增产[10]。最近报道该基因对盐、热和渗透胁迫及ABA均有响应[24]。

蒙古沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)是豆科沙冬青属的一个种，为古老的珍稀濒危常绿阔叶强旱生灌木，主要分布于中国西北干旱荒漠区，具有很强的耐寒、耐旱和耐盐碱特性[25]。前期通过构建cDNA文库从该物种获得一段RD22基因的cDNA序列，命名为AmRD22。本研究对该基因进行了克隆、表达分析和转基因功能鉴定，为其耐逆功能和作用机理研究提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料及处理

蒙古沙冬青种子由内蒙古巴彦淖尔市磴口县林业局提供，野生型拟南芥(哥伦比亚0型)种子、植物表达载体pCOMBIA3301(p3301)、大肠杆菌(E.coli)菌株DH5α和根癌农杆菌菌株GV3101由本实验室保存。

1.1.1 野外取样蒙古沙冬青野外植株的嫩叶采自内蒙古蒙草抗旱股份有限公司野生植物园区的成年植株，地点位于呼和浩特市南郊，取样于2013年7月-2014年5月按月进行。

1.1.2 胁迫处理将蒙古沙冬青种子用1.0%的次氯酸钠溶液灭菌15 min，用灭菌水漂洗5次，置于铺有滤纸、加适量灭菌水的培养皿中，于25 ℃催芽4 d。将萌发的种子移栽到河沙土中，于25 ℃、每天16 h光照和8 h黑暗下培养2个月，然后对幼苗进行不同胁迫处理：(1)干燥失水。从培养盆中取出幼苗并用自来水漂洗干净，置于25 ℃下自然干燥；(2)盐胁迫。用300 mmol/L的NaCl溶液浇幼苗一次；(3)低温。将盆栽苗放入低温光照培养箱(BD-PRX-1000A，下同)中进行4 ℃/12 h、0 ℃/10 h和-6 ℃/2 h的连续降温处理；(4)ABA处理。从培养盆中取出幼苗并用自来水漂洗干净，先浸根于1×MS大量元素培养液中24 h(预处理)，再浸根于含100 μmol/L ABA的1×MS大量元素培养液中，用小气泵通气。

4种处理均在处理前(0 h，对照)和处理开始后1、3、8和24 h各取5株幼苗为样品，其中盐和低温处理分别用室温和4 ℃预冷的自来水漂洗根部沙土。所有样品用液氮速冻后保存于-76 ℃。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆以AmRD22部分序列(852 bp，5′端不完整)为模板设计引物5′-GTTTCTTTGTCTACTTCAGTGGATAC-3′(outer)和5′-CTTTT-CCTCACCTCTAATGCCAG-3′(inner)，利用TaKaRa公司5′-RACE试剂盒进行5′-RACE反应，获得其5′端序列并与原序列拼接，得到其全长cDNA序列。在此序列的编码区两侧设计引物5′-AAAGATCTACCTCTACCACCACCAAG-3′(上游，加BglⅡ切点)和5′-GTGGTCACCTAAATCTACTTGGGAAC-3′(下游，加BstEⅡ切点)，以蒙古沙冬青低温胁迫全长cDNA文库[26]为模板进行PCR。将扩增片段与pMD19-T载体(TaKaRa公司)连接并用热激法转化E.coliDH5α，经菌落PCR检测获得阳性克隆，送北京华大基因公司测序。

1.2.2 蛋白序列分析利用DNAMAN软件预测分子量和等电点；利用Myhits SIB Motif Scan(https://myhits.sib.swiss/cgi-bin/motif_scan)检索BURP结构域；利用SignalP 5.0 Server(https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?SignalP-5.0)分析信号肽；利用Plant-mPLoc server 2.0(http://www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/plant-multi/)预测亚细胞定位；利用MEGA7.0软件通过邻接法构建进化树，均采用默认参数。

1.2.3 基因表达分析用Trizol法从-76 ℃冻存样品中提取总RNA，经DNase(TaKaRa公司)纯化后用M-MLV逆转录酶(TaKaRa公司)合成cDNA第一链，以蒙古沙冬青AmActin作为内参基因(5′-TGTTTCCGGGTATTGCTGAC-3′和5′-ACCCAGAGCCATCAAATAAG-3′)，用AmRD22特异引物5′-TGTGCCTTTGGAAGGTGCGG-3′和5′-TCTACTTGGGAACCCAGACAACG-3′进行RT-PCR。反应体系中含10×EasyTaq酶缓冲液1.5 μL、dNTPs(2.5 mmol/L each)1.2 μL、上下游引物各0.3 μL(10 μmol/L)、EasyTaq酶(5 U/μL，北京全式金生物技术有限公司)0.15 μL，cDNA模板(稀释10倍)经内参基因均一化而定，用ddH2O补足至15 μL。PCR程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 7 min；4 ℃保温。产物在1.8%琼脂糖凝胶上电泳，利用Image J软件扫描胶图得出灰度值，计算处理样品相对于其对照样品(灰度值为1)的变化倍数。实验重复3次。

1.2.4 表达载体构建及转化拟南芥用质粒小提试剂盒(天根生物公司)提取克隆载体pMD19-AmRD22和植物表达载体p3301 DNA，用BglⅡ和BstEⅡ(TaKaRa公司)进行双酶切。将酶切产物进行电泳分离、目的片段回收和连接反应，然后用热激法转化E.coliDH5α。再经菌落PCR检测和质粒酶切鉴定(BglⅡ和BstEⅡ)获得重组表达载体。将其用冻融法转化农杆菌GV3101并用AmRD22引物进行菌落PCR检测，所得阳性克隆用于配制转化菌液。

用常规方法将野生型拟南芥培养至花蕾初现，采用农杆菌蘸花法对其进行转化，按照张文君等[27]方法进行转化幼苗的筛选与PCR和半定量RT-PCR检测，获得AmRD22表达量较高的转基因株系。

1.2.5 转基因拟南芥耐逆性鉴定用T3代纯合体进行耐逆性鉴定：(1)耐旱性鉴定。将种子在附加300或350 mmol/L甘露醇的1/2 MS固体培养基上培养，将2～3周龄的盆栽苗停止浇水15～18 d，再恢复正常浇水；(2)耐盐性鉴定。将种子在附加150或175 mmol/L NaCl的1/2 MS固体培养基上培养，将盆栽10～15 d的幼苗浇200或300 mmol/L的NaCl溶液一次，4 d后恢复正常浇水；(3)耐冷耐冻性鉴定。将种子点种于1/2 MS培养基上于4 ℃放置3 d，然后放入6～8 ℃低温光照培养箱中培养，将2～3周龄盆栽苗依次进行4 ℃/24 h、-6 ℃/6～8 h和4 ℃/24 h处理，之后恢复正常培养；(4)ABA敏感性鉴定。将种子在附加0.75或1.00 μmol/L ABA的1/2 MS固体培养基上培养；(5)Na+含量测定。用250 mmol/L的NaCl溶液浇3周龄盆栽苗一次，5 d后收集幼苗并用自来水和ddH2O漂洗干净，置于80 ℃烘干至衡重，用原子吸收分光光度计(Zeenit Toop，Jenna，Germany)测定Na+含量。

上述实验均以野生型拟南芥为对照，每次实验每份材料至少用50粒种子或20株幼苗，实验过程中观测种子萌发和幼苗生长与存活等状况。实验重复3～5次。利用SPSS软件包中的Duncan法进行转基因株系与野生型之间的差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 AmRD22基因的克隆及其编码蛋白分析

在前期得到了AmRD22的部分cDNA序列，其5′端不完整。本研究通过5′-RACE(图 1，A)得到其5′端序列(761 bp)，与原序列拼接后获得其全长cDNA序列(1 495 bp)，其中包含1 080 bp的完整编码区。再通过PCR，从蒙古沙冬青低温胁迫全长cDNA文库[26]中扩增到该编码区片段(图 1，B)。推测其编码蛋白含360 aa，相对分子质量为38.8 kD，等电点为8.4，初级结构由N末端21 aa的信号肽序列、34 aa的保守区、含3个TXV重复单元(TXVXVGKGGVNVXAX0～2KGKP，其中X为任意aa，0～2为其数目，后同)的可变区(92 aa)和C端213 aa的BURP结构域组成(图 1，C)。信号肽中有16个疏水性aa，可变区重复单元中含T-V-VG-GGV保守序列，BURP结构域中含4个高度保守的半胱氨酸(C)-组氨酸(H)基序(排列方式：CHX10CHX25CHX25CH)和苏氨酸、脯氨酸、缬氨酸、色氨酸(T、P、V、W)等高保守残基。此外，预测到AmRD22蛋白定位于细胞壁。

用AmRD22序列在GenBank中进行BlastP，发现与其序列相似性高的前3个蛋白依次为白羽扇豆(Lupinusalbus，78.0%)、狭叶羽扇豆(L.angustifolius，78.0%)和相思子(Abrusprecatorius，74.0%)的RD22或BURP蛋白，但目前尚未查到其研究报道。用AmRD22和其他植物中功能较明确的5个RD22蛋白构建进化树，发现它与大豆GmRD22(ACM47360)和葡萄VvRD22(AAV36561)的关系较近，而与陆地棉GhRDL1(AAL67991)、拟南芥AtRD22(NP_197943)和咖啡CaBDP1的关系较远(图 2)。AmRD22与这些蛋白的序列相似性在45.4%～73.0%。

2.2 AmRD22基因的表达分析

室内培养下蒙古沙冬青幼苗中AmRD22在不同胁迫处理下的表达结果(图 3，A、B)显示：正常培养条件下(0 h，对照)该基因有明显表达；干燥失水1～8 h后其表达量持续增加，24 h后明显回落但仍显著高于对照，4个时间点的平均表达量为对照的3.2倍；盐胁迫1～8 h其表达量显著高于对照，24 h后则显著低于对照，平均表达量为对照的1.4倍；低温处理期间其表达量呈现升-降-升的变化趋势，但均显著高于对照，平均为对照的3.7倍；ABA处理1～8 h其表达量也显著高于对照，平均为对照的2.6倍，其中处理3 h表达量最高。这些结果说明4种胁迫处理均可诱导AmRD22的表达量显著上调，但在时间进程和变化幅度上有所不同。

不同季节野外生长蒙古沙冬青成年植株叶片中AmRD22的表达变化模式(图 3，C、D)表明，在7月上旬该基因只有少量表达，进入9月下旬其表达量明显升高；从10月中旬至翌年1月中旬(中秋至隆冬)其表达量远高于前2个月；在3月中旬和5月中旬其表达量又变得非常微弱。如以该基因在7月上旬(气温较适宜)的表达量作为对照，从10月中旬至翌年1月中旬其表达量平均上调了6.9倍。由此可见，AmRD22参与了蒙古沙冬青对秋、冬季寒冷天气的响应。

2.3 AmRD22转基因拟南芥耐逆性鉴定

成功构建了植物表达载体p3301-35S-AmRD22并通过农杆菌介导法转化拟南芥。对所得T1和T2代幼苗分别进行PPT筛选、PCR检测和半定量RT-PCR分析(图 4)，获得了4个AmRD22表达量较高的拟南芥转基因株系R1、R3、R5和R9，用其T3代纯合体进行耐逆性鉴定。

2.3.1 耐旱性鉴定耐旱性鉴定首先在种子萌发期进行，结果见图 5。在1/2 MS培养基(0 mmol/L甘露醇)上，4个转基因株系与野生型(WT)的种子萌发和幼苗生长状况无明显差异，但在其中附加300或350 mmol/L甘露醇后，前者的萌发和生长状况均好于后者。以附加300 mmol/L甘露醇培养基上培养7 d时为例，WT的萌发率和幼苗根长分别为58.8%和4.5 mm，而4个转基因株系分别为63.4%～78.3%和5.8～6.8 mm，其中R3、R5和R9株系的萌发率或根长显著大于WT。然而，进一步在苗期进行控水干旱和复水处理，未发现4个株系与WT在耐旱性上存在明显差异。这些结果表明，AmRD22的组成型表达提高了转基因拟南芥在种子萌发期的耐旱性。

2.3.2 耐盐性鉴定转基因株系种子萌发期耐盐性的鉴定结果见图 6。在不含NaCl的1/2 MS培养基上，转基因株系与WT的种子萌发和幼苗生长状况相近，而在附加150或175 mmol/L NaCl的培养基上前者明显好于后者。培养7 d时统计，WT在这两种培养基上的萌发率分别为51.5%和21.7%，而4个转基因株系分别为76.8%～90.9%和55.4%～65.9%，均显著高于WT；WT的根长分别为4.2 mm和2.1 mm，而4个株系的根长分别为6.0～7.8 mm和4.0～4.4 mm，其中R3、R5和R9株系显著长于WT。

苗期耐盐性的鉴定结果见图 7。未浇盐水前，4个株系与WT之间无明显差异。当浇以200 mmol/L的NaCl溶液后，WT幼苗的生长受到明显抑制且有少数莲座叶变得枯黄，而转基因幼苗受抑制的程度明显较轻且叶色基本正常(图 7，A)；浇盐水20 d后测量株高，WT为12.6 mm，而4个转基因株系为29.4～36.0 mm，均显著高于WT(图 7，B)。若浇以300 mmol/L的NaCl溶液，WT会受到明显伤害且大部分幼苗逐渐枯死，而转基因幼苗受伤害的程度较轻，有部分幼苗能够存活下来(图 7，C)；浇盐水15 d后统计存活率，WT为33.1%，而4个转基因株系为60.9%～72.5%，均显著高于WT(图 7，D)。

上述结果表明，AmRD22的组成型表达显著提高了转基因拟南芥在种子萌发期和苗期的耐盐性。4个株系相比，以R3和R9株系的耐盐性较高(图 6；图 7，A-D)，为此测定了二者的Na+含量。从图 7，E可见，浇250 mmol/L的NaCl溶液5 d后，R3和R9株系的Na+含量均低于WT，表明AmRD22的组成型表达减少了转基因拟南芥中Na+的积累。

2.3.3 ABA敏感性鉴定众所周知，ABA对种子萌发和幼苗生长有抑制作用[28]，上述表达分析也显示外源ABA可诱导AmRD22表达量上调，为此观测了转基因种子在ABA胁迫下的萌发状况。结果显示，在附加0.75或1.00 μmol/L ABA的培养基上，转基因种子在培养早期的萌发速度和胚根生长快于WT，但在培养一周左右这种差异基本消失。图 8为培养4 d时的观测结果，其中R3和R9株系与WT的萌发率和/或幼苗根长有显著差异。这表明AmRD22可降低转基因拟南芥在种子萌发早期对外源ABA抑制的敏感性。

此外，对转基因株系在种子萌发期和苗期的耐冷耐冻表型进行了观察，结果未发现有明显变化。

上述结果表明，AmRD22主要在耐盐性中发挥功能，在耐旱性和ABA敏感性中也起一定作用，但对低温耐性无明显影响。

3 讨 论

RD22s是植物中普遍存在的一类逆境相关基因，其编码蛋白多数由N端信号肽、短保守区、可变区和BURP结构域4部分组成[2]，也有少数RD22，如OsBURP05和ZmBURP04的编码蛋白无信号肽或BURP结构域不完整[29-30]。N端信号肽的存在意味着其属于分泌性蛋白，可能定位于细胞壁或质外体并在此发挥功能，此推测已在GmRD22、GhRDL1和AtRD22得到验证[9-10]。可变区是不同RD22蛋白间差异最明显的部分，主要由所含TXV重复单元数不同导致。多数RD22蛋白可变区内含3～5个TXV重复，每个重复单元中常含有T-V-VG-GGV保守序列，可能对维持RD22蛋白的结构和功能起重要作用[2,5]。BURP结构域是RD22亚族最保守的区域，常含有4个排列较稳定的CH基序和T、P、W等高保守残基[6-8,24]，对决定其亚细胞定位和行使功能非常重要[9-10,17]。本研究发现AmRD22基因的编码蛋白含有RD22亚族的上述4部分区域，并且其可变区内的T-V-VG-GGV保守序列和BURP结构域中的CH基序及T、P等高保守氨基酸齐全，故属于典型的RD22亚家族成员，具备行使功能的基本结构基础。在分子进化上，AmRD22与生理功能较明确的GmRD22和VvRD22关系较近，而与GhRDL1、AtRD22和CaBDP1关系较远。这些信息为研究AmRD22的功能提供了重要参考依据。

前人发现RD22类基因的主要功能是参与对干旱/失水和盐胁迫的响应并影响植物的耐盐性和耐旱性，其中GmRD22、Tard22、Trrd22和VvRD22对耐盐性和/或耐旱性起正调节作用[9,19-21]，而CaBDP1和AtRD22的作用与之相反[12,15]。蒙古沙冬青具有很强的综合耐逆性，尤其以超常的耐寒性而著称[25]，挖掘其耐寒基因是我们主要的研究兴趣和目标所在。本研究发现AmRD22在失水、高盐和低温胁迫、尤其是秋季和冬季寒冷天气下表达量明显增加，推测其可能在抵御这些逆境、尤其是低温逆境中起重要作用。然而，将该基因转入拟南芥中表达显著提高了其耐盐性，其次是耐旱性，而对其耐冷性和耐冻性无明显影响。这可能与异源表达和拟南芥本身具有较强的耐低温特性有关，也可能是该基因自身的耐冷、耐冻功能本就微弱使然。由于蒙古沙冬青遗传转化体系尚未建立，我们已构建AmRD22转基因杨树和水稻并开展相关工作，以期进一步验证其耐逆功能和利用价值。

有关RD22s的耐逆作用机制目前所知甚少，仅有Wang等[9]报道与木质素有关。木质素是植物细胞壁的重要组分[31]，尤其在根内皮层细胞壁上的凯氏带中大量沉积[32-33]。它不仅能增强细胞壁的机械强度和保护作用，而且可阻止离子和水分通过质外体途径进出植物体，在适应或抵抗高盐和干旱等逆境胁迫中起重要作用[31-33]。Wang等[9]发现，GmRD22定位于质外体并可与催化木质素聚合的细胞壁过氧化物酶GmPer1互作，将GmRD22在拟南芥和水稻中表达可提高二者对高盐和渗透胁迫的耐受性及木质素含量，同时GmPer1在拟南芥和水稻中的同源基因受盐胁迫诱导表达量明显上调。据此他们认为GmRD22可能与转基因植株中的Per1类蛋白互作并激活其酶活性，从而促进了木质素的合成，增强了转基因细胞在胁迫条件下的完整性和植株的耐逆性。我们发现AmRD22与GmRD22高度同源且定位于细胞壁，AmRD22的组成型表达降低了盐胁迫下转基因株系的Na+含量，推测AmRD22可能以类似于GmRD22的机制发挥其耐盐耐旱作用。植物细胞壁是由多种成分组成的复杂动态结构，AmRD22也可能以其他方式作用于细胞壁或质外体而发挥其耐逆保护功能。要弄清其作用机理还需开展大量深入细致的工作。

ABA是重要的激素类信号分子，具有调控逆境胁迫响应基因表达和抑制种子萌发及幼苗生长等重要功能[28]。目前所知有许多RD22基因的表达受ABA调控，可能通过依赖于ABA的信号途径发挥功能，其中AtRD22、Gm06.2/GmRD22和CaBDP1的研究较为清楚。AtRD22的启动子区含ABA应答相关元件，其表达受失水、盐胁迫和外源ABA诱导且需要ABA信号通路转录激活因子AtMYC2/rd22BP1和AtMYB2的合成与介导[3,13-14]。Gm06.2/GmRD22和CaBDP1的表达也受外源ABA诱导，其中前者的启动子区含有ABA应答元件ABRE，后者转入拟南芥可增强种子萌发期对外源ABA的敏感性[6,12]。本研究发现AmRD22的表达受不同非生物胁迫和外源ABA诱导，将其在拟南芥中表达增强了转基因株系的耐盐性和耐旱性，同时降低了其在种子萌发早期对外源ABA的敏感性，推测该基因通过依赖于ABA的信号途径发挥功能。