豌豆种质资源耐盐性的鉴定与评价

亚秀秀，杨东旭，周桂梅，陈 健，刘振兴

（唐山市农业科学研究院，河北 唐山 063000）

土壤盐碱化不同程度抑制植物的生长，甚至寸草不生，盐碱地是制约我国农业的发展的主要因素。我国盐碱地面积约有9.913×107hm2，河北省盐碱耕地总面积为7.8×105hm2，占总耕地面积的10.4%，河北省盐碱地有很大的利用潜力[1]。滨海盐碱地是河北省盐碱地的主要类型，2010年河北省委省政府提出了以秦皇岛、唐山和沧州沿海487 km海岸线为研究区域发展沿海经济，开展适生植物选择的科技攻关研究，为河北省沿海地区生态环境可持续发展提供科技支撑[2-3]。

豌豆（Pisum sativumL.），是世界第四大食用豆类作物[4]。一年生草本，属粮食（干豌豆）、蔬菜（鲜食豌豆）和饲料兼用型作物[5]，具有环境适应力强，耐寒冷、耐干旱以及耐贫瘠能力强等特性，且具有一定的抗盐碱性[6]，豌豆对重金属Pb胁迫也具有一定的耐性，可用于轻度Pb污染环境的修复[7]。河北省是我国主要的豌豆生产区[8]，筛选耐盐豌豆种质，对实现河北滨海盐碱地的改良和利用，变盐碱地为盐碱耕地，推动我国盐碱农业的发展具有十分重要的意义。

国内耐盐作物品种选育的研究报道，主要集中在水稻[9-11]、小麦[12-13]、大豆[14]、花生[15-17]和油菜[18-22]等作物，豌豆耐盐筛选评价的研究报道很少。有研究采用梯度浓度NaCl溶液胁迫甘肃大豌豆，结果显示100～120 mmol/L的是豌豆生长最适盐浓度，浓度继续升高会抑制豌豆的生长[23]。前人[24-25]对菜用豌豆、芸豆萌发期进行NaCl溶液和NaHCO3溶液胁迫对比试验，结果均显示碱性盐NaHCO3比中性盐NaCl对种子萌发和幼苗生长的抑制作用更为明显。滨海盐碱地土壤主要中主要阳离子是Na+，主要阴离子是Cl-，还有少量的SO42-和HCO3-，土壤pH在7.9～8.7之间[26]。本试验为模拟天然的沿海地区土壤类型和PH值，采用NaCl、Na2S04和NaHCO3按照比例混合配置不同梯度的盐溶液，以32个豌豆品种（品系）为材料，对豌豆萌发期进行混合盐胁迫实验，研究混合盐胁迫对豌豆萌发期的影响，初步筛选一批耐盐豌豆种质，为后期河北沿海地区盐碱耕地的改良利用与豌豆耐盐碱生理研究提供基础种质资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

唐山市农业科学研究院油料杂粮研究所自育豌豆材料和国家食用豆体系豌豆新品种联合鉴定材料32个（表1）。

表1 本试验使用的32个豌豆材料Table 1 32 pea materials used in this test

1.2 种子处理

每个材料选籽粒饱满、均匀的适量豌豆种子，10%NaClO浸泡消毒10 min，蒸馏水清洗3遍，吸干水分备用。

1.3 混合液配制与培养

根据滨海地区盐碱地盐分组成[26]，分别选定3种盐NaCl、Na2SO4和NaHCO3按照摩尔比1∶2∶1混合配置盐碱液，配置成浓度 50、100、150、200和250 mmol/L的处理液。玻璃培养皿（直径大小120 mm）中放滤纸2层，每个材料分别选取已消毒豌豆种子100粒均匀放在滤纸上，设置3个重复。每个培养皿分别加入供试处理液40 mL，对照组（CK）加入等量的40 mL蒸馏水。光照培养箱中进行培养，温度（20±1）℃，光照12 h光照/12 h黑暗，相对湿度60%。

1.4 记录标准

记录萌发的种子数（芽长超过种子一半即为萌发），第3天统计种子发芽势（germination potential，GP），第7天统计种子发芽率（germination rate，GR），每个处理随机取10株幼苗，测芽长（shoot length，SL）、根长（root length，RL）、芽鲜重（shoot fresh weight，SFW）和根鲜重（root fresh weight，RFW）。

分别计算各个指标的相对值，各项指标相对值的计算方法参照毕新华等[27]的计算方法，各指标的相对值英文缩写分别在前面加上“R”。

指标相对值=处理指标值/对照指标值×100%

1.5 数据处理

利用Microsoft Excel 2007、DPS v.9.01和SPSS统计软件对所有数据进行整理，统计分析。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的混合盐对豌豆种子萌发的影响

为确定筛选耐盐豌豆种质的混合盐浓度，选取8个遗传距离较远的豌豆品种（系），分别为 QW03A、RC09、S3009、TW201630、G05429、woq（2q）-2-2-1-1、QW20和0309，5个浓度梯度混合盐溶液进行胁迫处理试验。结果显示如下（图1），与对照组相比，随着混合盐碱液浓度的升高，8份豌豆材料种子萌发表现为发芽率降低，发芽势减慢，种子萌发芽长渐短、根长渐短、嫩芽逐渐褪绿，高浓度混合盐对豌豆的种子萌发与生长造成严重迫害。8个豌豆品种（系）萌发期形态指标的测定，图2显示，不同浓度的混合盐胁迫下，豌豆的相对芽长、相对根长、相对芽鲜重以及相对根鲜重均产生很大影响，随着混合盐溶液浓度的不断升高，所测指标均不断降低，其中相对芽鲜重与相对芽长下降更明显，对于混合盐溶液的敏感度相对芽鲜重>相对芽长>相对根长>相对根鲜重，混合盐溶液浓度升高至250 mmol/L时，种子成苗数太低，不足以测量形态指标，因此未有数据。

图1 萌发期盐胁迫豌豆品系0309的耐盐性表现Figure 1 Salt tolerance of pea strain 0309 under salt stress at germination stage

图2 不同浓度混合盐溶液对豌豆种子萌发期形态指标的影响Figure 2 Effects of mixed salt solution of different concentration on morphological indexes of pea germination

图3显示，随着混合盐溶液浓度的升高，种子的相对发芽率和相对发芽势呈不断降低的趋势。浓度为50 mmol/L时相对发芽势与相对发芽率降低不明显，分别为97.34%和99.48%；浓度100 mmol/L时相对发芽势显著降低，相对发芽率降低不明显，分别为72.53%和98.33%；浓度150 mmol/L时，相对发芽势和相对发芽率均呈现迅速降低，分别下降到28.27%和69.04%，此浓度下各品种间相对发芽率的标准差也达到最大（图4），浓度200 mmol/L种子萌发受到严重抑制，相对发芽势降到8.64%，74.76%的种子完全不能萌发，浓度升高至250 mmol/L时，相对发芽势降到3.57%，84.14%的种子完全不能萌发。综合8个豌豆品种（系）相对发芽势和相对发芽率数据显示（图4），150 mmol/L浓度下相对发芽率标准差达到最大，表明150 mmol/L下各个豌豆品种（系）间的发芽率差异达到最大，因此可确定为本试验耐盐豌豆筛选的最适宜混合盐溶液浓度。

图3 不同浓度混合盐溶液对相对发芽势、相对发芽率的影响Figure 3 Effects of different concentration of mixed salt solution on RGP and RGR

图4 盐胁迫下不同品种间相对发芽势、相对发芽率的标准差比较Figure 4 Comparison of the SD of RGP and RGR among different varieties under salt stress

2.2 豌豆品种（系）耐盐性主成分分析及综合评价

混合盐溶液浓度为150 mmol/L时，各个豌豆材料的相对发芽率差异最大，同时可保证各个豌豆材料的幼苗数，是本试验筛选和评价豌豆耐盐性的最适混合盐溶液胁迫浓度。因此，利用150 mmol/L混合盐溶液对其他24个豌豆品种（系）的萌发期进行胁迫，对测定的所有豌豆品种（系）的萌发期指标值进行统计学分析，每个豌豆品种（系）3次重复数据取平均值，DPS软件对32个豌豆品种（系）指标的平均值进行方差分析结果如下（表2）。

表2 150 mmol/L盐液浓度下各豌豆材料指标值Table 2 Index values of each pea material at the 150 mmol/L salt solution

每个豌豆品种（系）的萌发期的6个测定指标在盐胁迫下的表现各不相同，通过主成分分析可以将多个指标信息降维为3个综合指标，构建豌豆耐盐性的综合评价指标体系。利用DPS软件对32个豌豆品种（系）的6个萌发期指标的平均值进行主成分分析结果如下（表3），第三个主成分的累计贡献率达到了80.18%，能够代表大部分的豌豆耐盐性信息。表3中指标的贡献率、累计贡献率和特征向量值表明，第一主成分相对发芽率所占比率最大；第二主成分中相对芽鲜重占比例最大；第三个主成分与相对发芽势、相对芽长和相对根长呈强正相关，其中相对发芽势所占比率最大。因此，相对发芽率、相对芽鲜重以及相对发芽势3个指标可以构成豌豆耐盐性及豌豆耐盐种质资源筛选的评价指标。

表3 豌豆萌发期主成分分析的综合指标及其贡献率和特征值Table 3 Comprehensive index，contribution rate and eigenvalues of PCA of pea germination

2.3 耐盐豌豆种质资源初步筛选

利用SPSS统计软件的WARD法对豌豆品种（系）的主成分指标数据进行系统聚类分析（图4），结合表2豌豆品种（系）在0.01显著水平下的方差分析结果，将品种依照耐盐性进行归类。结果显示，32个豌豆品种（系）根据耐盐性可以分为4个等级，分别为QW27、法国618、G05429、TW201619、0309、TW201630、2014-W-503和QW28共8个萌发期高度耐盐豌豆品种（系），QW03A、9618-2、G05428共3个耐盐豌豆品种（系），中豌6号、G05634、QW10 TW201608、TW201616、TW201620和TW201605共7个中耐盐豌豆品种（系），S3009、QW9、G05645、加拿大青豌豆、9017、QW20、G05638、成豌 1号、Woq（2q）-2-2-1-1以及2011-65共10个盐敏感豌豆品种（系）。

图5 32份豌豆材料萌发期耐盐性聚类分析Figure 5 Cluster analysis of salt tolerance of 32 pea materials at germination stage

3 讨论与结论

前人对豌豆盐胁迫试验研究多采用单一的中性盐NaCl[28-30]或单一的碱性盐NaHCO3[6]。检测滨海盐碱地土壤酸碱度及土壤离子成分发现，土壤中除了氯化盐（NaCl）害之外，还存在硫酸盐（Na2SO4）和碱性盐（NaHCO3）害[26]，混合盐溶液的配置更好模拟了滨海盐碱地土壤成分，提高了筛选耐盐豌豆品种（系）的准确性。豌豆萌发期盐碱胁迫预试验中，随着混合盐溶液浓度的不断增高，豌豆种子的萌发与生长受到不同程度的抑制，不同豌豆品种（系）响应混合盐溶液胁迫的表现呈现显著不同，证明豌豆萌发期混合盐胁迫法是评价豌豆种质耐盐性和筛选耐盐豌豆种质的有效方法，萌发期是耐盐豌豆种质筛选试验的有效生理期。本研究结果表明了混合盐碱液浓度150 mmol/L（pH=8.6）为筛选耐盐豌豆的最适浓度，可作为耐盐豌豆筛选与评价试验的有效混合盐浓度。前人对豌豆胁迫试验研究中，溶液组成主要是单一NaCL、单一Na2CO3或单一NaHCO3，最适生长浓度 NaCL<100 mmol/L[28,31-32]，Na2CO3<25 mmol/L[32-33]，NaHCO3<25 mmol/L[24]。 因此不同品种间遗传基因差异或者溶液离子组成不同，会造成胁迫试验最适浓度各不相同，本试验150 mmol/L为耐盐豌豆筛选的最适混合钠盐（NaCL、NaHCO3、Na2SO4）胁迫浓度，可为今后豌豆耐盐研究提供参考依据。

目前，豌豆萌发期耐盐性指标筛选及耐盐性评价还缺乏系统性的研究。植物耐盐性的评价是一个复杂的过程，需要对多个指标进行综合评价。本试验利用主成分分析法对多个萌发期测量指标进行降维，结果显示了相对发芽率、相对芽鲜重以及相对发芽势分别在三个主成分中占的比重最大。因此相对发芽率、相对芽鲜重以及相对发芽势等指标构成了豌豆耐盐性及耐盐豌豆初步筛选的评价指标体系，同张国伟[34]、王军[35]和蔺吉祥等[36]研究表明种子萌发时期的发芽率是植物耐盐筛选的理想指标的研究结果相符。杨柯等[31]发现豌豆品种陇豌1号和S4008萌发时胚根对盐胁迫更为敏感，与本试验中相对芽长对混合盐胁迫的敏感度大于相对根长的结果不同，可能与品种间遗传基因的差异或盐溶液成分相关，在今后耐盐豌豆筛选试验中，可以作为参考。

聚类分析根据豌豆萌发期的耐盐能力将32个豌豆品种（系）分为了4类，高度耐盐碱的豌豆品种（系）8个，盐胁迫敏感豌豆品种（系）10个，根据实际需要将作为耐盐豌豆种质资源进行盐碱地引种试验。前人研究表明，豌豆受盐分迫害严重主要在萌发期和苗期，筛选萌发期和苗期的耐盐豌豆品种是盐碱地种植及豌豆耐盐性育种的关键[37]。下一步的工作，将基于萌发期初步筛选的耐盐豌豆品种（系），苗期进行耐盐种质资源的进一步筛选鉴定及豌豆耐盐育种研究，选育高耐盐的优良豌豆品种，为滨海盐碱地的改良利用及豌豆耐盐机制研究提供种质基础和理论依据。