不同基因型普通菜豆再生能力研究

程 媛，马朋涛，武 晶

（1.烟台大学生命科学学院，山东 烟台 264005；2.中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081）

普通菜豆(Phaseolus vulgarisL.)又称芸豆、四季豆，属豆科、菜豆属作物，是食用人群最多的食用豆类。普通菜豆籽粒富含铁、钙、镁、锰和钾等矿物质元素[1]，具有高蛋白、中淀粉、低脂肪以及营养元素丰富等特点，是人类饮食中植物蛋白的重要来源[2]，深受消费者的喜爱。普通菜豆在l5世纪从欧洲引入中国，已有500多年的栽培历史[3]。目前，中国种植的普通菜豆大多为地方品种，主要分布于云南、贵州、山西、陕西、甘肃、内蒙古和黑龙江等省区[4]，是中国主要的出口创汇商品之一[5]。

植物转基因技术作为一种生物技术手段，彻底打破了常规育种中物种间的限制，实现了不同物种之间遗传物质的重组。再生系统的建立是转基因技术的关键步骤，而普通菜豆是菜豆属中再生和遗传转化最困难的作物[6]。在1976年O.J.Crocomo等[7]首次获得了2株普通菜豆再生植株，随后对普通菜豆的大量再生研究表明其存在两种再生途径：器官发生途径和体细胞发生途径[8]。其中，器官发生途径包括直接器官发生途径和间接器官发生途径。

目前，建立的普通菜豆再生体系大部分是直接器官发生途径。直接器官发生途径是不经过愈伤组织形成阶段，直接从外植体的叶肉细胞、表层细胞或分生组织诱导形成不定芽。例如，M.Santalla等[9]挑选出10个优良品种和7个地方品种，将胚轴作为外植体进行再生试验，得到了再生植株。M.H.Cruz等[10]利用14 d龄菜豆植株的横向薄细胞层实现了高频率的再生。P.Delgado-Sa′nchez等[11]利用成熟种子胚轴对两个商业菜豆品种实现了有效再生。此外，普通菜豆的再生体系还有子叶节再生体系[12]、芽顶端分生组织再生体系[13]、幼叶的叶柄再生体系等[14]。由于不同类型外植体生理状态差异，对于外界诱导、分化和再生能力有所不同[15]。M.Saxena[16]比较了不同外植体的再生效率，发现带腋芽的子叶节、叶柄和子叶节的再生效率分别为78%、62%和82%。2021年Yu Y.等[17]将子叶节、胚轴和根段作为外植体进行普通菜豆再生试验，结果发现利用胚轴的再生芽率达74.21%，高于另外两种外植体的再生芽率。然而，关于普通菜豆间接器官发生途径报道很少。间接器官发生途径是通过脱分化形成愈伤组织再分化成植株。M.F.Mohamed等[18]首次利用花梗作为外植体诱导愈伤组织，获得了再生植株；M.A.Zambre等[19]从普通菜豆育种品系Xan-159的子叶和胚轴诱导愈伤组织，发现从子叶诱导愈伤组织上获得了可育的再生植株，再生效率达39%。J.Arellano等[20]将子叶节作为外植体，在含有0.34 mg/L 2，4-D的培养基上诱导愈伤组织再生出芽，再生芽效率达50%左右。随后，R.Collado等[21]利用不同的外植体诱导愈伤组织，并且测定了不同浓度的TDZ和BAP对愈伤组织诱导再生芽的影响，试验结果发现在添加2.25或4.50 mg/L的BAP的培养基再生效果最佳，建立了一种可以应用于5种类型的普通菜豆的间接器官再生系统。Yu Y.等[17]发现添加0.5 mg/L的TDZ诱导愈伤组织能力最强，诱导率达到91.51%，在芽诱导培养基上添加1.0 mg/L的BAP后，芽再生频率高达93.33%。

与器官发生途径相比，采用体细胞发生途径对普通菜豆进行再生的报道较少。A.Allavena[22]和S.Martins等[23]分别从普通菜豆未成熟合子胚的小叶和顶芽诱导的愈伤组织中获得了胚状体，但后续均未得到发育。多年后，L.R.García等[8]从胚性愈伤组织中获得再生植株，再生效率达32%，并且发现体细胞胚的形成和萌发取决于外植体、培养基和光照条件。随后，J.L.Cabrera-ponce等[24]在培养基中添加细胞分裂素（BAP），结合渗透胁迫诱导获得不同阶段的体细胞胚，并分化形成了完整植株。

本试验拟通过直接器官再生途径将带有子叶节的胚轴作为外植体进行再生试验，筛选高再生芽率的基因型，为建立普通菜豆遗传转化和基因编辑技术体系奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验材料

普通菜豆经过长期驯化和地理隔离，形成了安第斯和中美洲两个多样性中心[25]。两个中心的普通菜豆在形态特征方面存在明显的差异，安第斯中心的普通菜豆籽粒大(百粒重>40 g)；而中美洲中心材料为中小籽粒（≤40 g）[26]。据报道，普通菜豆大粒品种再生十分困难[27]。因此，本试验从中美洲基因库中选取17份普通菜豆种质资源，从安第斯基因库中选取两份，总共19个品种，由中国农业科学院作物科学研究所提供（表1、图1）。

表1 所用普通菜豆详细信息Table 1 Details of the common beans used

图1 19份普通菜豆材料籽粒形态Figure 1 Grain morphology of 19 common beans

1.1.2 培养基

试验所用的培养基（表2）需经过121℃、0.12 MPa高压灭菌20 min，冷却至50℃～60℃时在无菌条件下加入激素（激素需经过滤器除菌），混匀，备用。

表2 试验所用培养基Table 2 Medium used in the experiment

1.2 试验方法

1.2.1 种子灭菌

采用氯气灭菌法。选取表面光滑、无病害且大小一致的普通菜豆种子于培养皿中。分散开以保证灭菌充足，培养皿敞开放在通风橱中的干燥器中，采用100 mL HClO+4 mL HCl氯气法进行灭菌18 h。

1.2.2 外植体的获得

外植体的获取参考Che P.等[28]的方法，并稍作改动。将无菌种子平放于发芽培养基上萌发，培养温度为25℃，光照18 h。当萌发的胚轴2～3 cm时获得无菌苗。不同品种萌发至相同状态时，统计不同基因型的发芽率。然后将萌发好的种子切除子叶、顶芽和胚根，只保留1～2 cm的胚轴及子叶节部位，即可获得外植体。

1.2.3 不定芽的诱导

将获得的外植体平放于芽诱导培养基上，25℃，光照18 h进行培养。培养至第2周时观察再生芽状态，切除下胚轴处褐色愈伤并进行继代处理。培养第5周时统计不同基因型的再生芽株数及个数，计算再生芽率以及平均再生芽个数。

1.2.4 不定根的诱导及再生植株的形成

芽诱导结束后，将≥1 cm的再生芽接种在生根培养基上。待其长出主根，炼苗2 d后，移栽于土中培养，继而获得再生植株。

1.2.5 试验数据统计方法

发芽率=发芽粒数/接种总粒数×100%，再生芽率=再生芽株数/接种外植体数×100%，再生芽数=再生芽总个数/再生芽株数，再生芽株数是再生芽大于等于1 cm的株数。

2 结果与分析

2.1 不同基因型发芽率的比较

种子萌发是再生过程中的第一步，发芽率决定着生长过程中品质优劣情况，是再生过程中一个重要的指标，因此首先对19份不同基因型的普通菜豆进行萌发试验。种子经过氯气灭菌处理后，平放于发芽培养基上进行萌发。试验发现不同基因型的普通菜豆发芽率存在差异，19份普通菜豆平均发芽率为87.4%，达90.0%以上的为细白羊角豆、BAT1198、F0003370、Preto Catarinense、IAPAR 57、Ouro Branco、F0005919、Michelite、Garbancillo Zarco、ICA Pijao、HR45、龙芸豆12和龙芸豆17等13个品种。其中，BAT1198、F0005919、Michelite、Garban⁃cillo Zarco、HR45和龙芸豆12发芽率达100%，BAT93、灰兰刀豆、英国红芸豆、黑芸豆、龙芸豆7号以及Centa Cuscatleco的发芽率低于平均值，并且F0004313的发芽率最低，仅为27.5%（图2）。同时，不同基因型的普通菜豆发芽速率不同，大粒品种发芽速率低于小粒品种，小粒品种5～6 d萌发至需要的状态（图3a），而大粒品种萌发到相同的状态需更长的时间，10～15 d。

图2 不同基因型普通菜豆发芽率Figure 2 The germination rate of common beans of different genotypes

图3 再生体系的关键技术流程Figure 3 Key technical process of the regeneration system

发芽率不同可能是因为种皮的硬度不同影响种子的吸水程度，种皮较硬的种子难以吸胀，影响发芽率。此外，种皮颜色对种子的萌发也有一定的影响，白色种皮的籽粒萌发能力较强，如BAT1198、Garbancillo Zarco和龙芸豆12等。

2.2 不同基因型菜豆再生形态分析

将获得的外植体平放于芽诱导培养基上（图3b），在相同条件下对19份普通菜豆进行芽诱导试验。芽诱导第二周时发现下胚轴处有愈伤生成，子叶节处伴有较小的再生芽长出（图3c），进行继代处理。在第5周时下胚轴愈伤膨大，再生芽伸长（图3d）。可观察到不同基因型普通菜豆再生芽的形态、长势情况也存在明显差异（图4）。BAT93、灰兰刀豆、F0003370、英国红芸豆、黑芸豆、IAPAR 57、Ouro Branco、龙芸豆 7 号、Garbancillo、ICA Pijao、龙芸豆17和HR45这12份材料再生芽较小（<1.5 cm），其中BAT93、英国红芸豆、Ouro Branco和HR45这4份材料在胚轴顶端伴随着丛芽生成。而细白羊角豆 、BAT1198、Preto Catarinense、F0005919、Michelite、Centa Cuscatleco和龙芸豆12等共7份材料再生芽较大（≥1.5 cm）。

图4 19份材料再生5周后状态Figure 4 19 materials status after 5 weeks of regeneration

2.3 不同基因型普通菜豆再生芽率和再生芽数分析

对19份普通菜豆进行2次重复再生试验发现，不同基因型的普通菜豆在相同条件中芽诱导效果差异显著。对试验数据进行处理分析，19份材料总平均再生芽率为56.8%。其中有8份材料平均再生芽率高于总平均再生芽率，从高到低依次为细白羊角豆、Ouro Branco、ICA Pijao、Garbancillo Zarco、F0005919、HR45、Centa Cuscatleco和龙芸豆12。细白羊角豆再生效果明显，再生芽率高达94.4%，平均再生芽率为90.8%。其次是Ouro Branco，平均再生芽率87.1%，而英国红芸豆再生芽率最低（表3）。统计再生芽株数和个数，计算平均再生芽个数发现，19份材料再生芽数差异不明显。每株再生芽个数在0～3个之间，平均再生芽个数在1.00～2.00个之间，相比较而言细白羊角豆再生芽个数较多，平均再生芽数为1.54个。

表3 19份材料再生芽率、平均再生芽数的比较Table 3 Comparison of regeneration bud rate and average number of regenerated

2.4 不同基因型普通菜豆生根能力及再生能力分析

将长出的再生芽从基部切下，转移到生根培养基中，进行生根试验。结果发现再生芽越大，生根速率越快，再生苗成活率也越高，大约30 d能长出茁壮的根系。反之，再生芽越小，生根越困难，形成的根系也越少。与此同时，还发现基因型对于生根没有直接影响，每个基因型较大的再生芽均能生根（图3e），而与再生芽的大小、茁壮程度有直接关系。当组培苗产生2～3个主根时，炼苗2 d，洗去培养基后移至土中培养大约60 d能结荚（图3f）。

对19份材料进行两次重复再生试验，发现细白羊角豆萌发能力强，发芽率高。再生过程中再生芽较大、较壮，再生芽率高达94.4%，平均再生芽率为90.8%，平均再生芽个数达1.54个，生根能力较强，与其他品种比较，再生效果显著。对多重数据进行分析认为细白羊角豆在19份材料中再生能力最强。初步认为细白羊角豆是这19份材料中最适宜的普通菜豆再生品种。

3 讨论与结论

目前，普通菜豆遗传转化体系还处在探索阶段，影响其转化效率的因素很多，其中高效稳定的再生体系是构建遗传转化体系的关键一环。植物器官的分化与再生依赖于基因型，因此筛选再生能力较强的基因型是高效诱导普通菜豆再生植株的关键，也是普通菜豆高效再生体系建立的前提。

本论文对19份不同普通菜豆基因型的再生能力进行比较分析，发现细白羊角豆的再生能力较好，为94.4%。K.A.Malik等[29]对6种不同基因型的普通菜豆进行再生试验，发现不同基因型的普通菜豆再生芽率存在差异。P.Delgado-sanchez等[30]将胚轴作为外植体，研究Flor de Junio Marcela（FJM）和Flor de Mayo Anita（FMA）这两个普通菜豆品种的再生情况，结果发现FJM再生芽率达83.0%，而FMA再生芽率仅为50.0%。G.Mukeshimana等[31]优化再生体系对4个普通菜豆品种进行再生试验，其中Merlot再生芽率最高，为93.0%，而Zorro再生芽率仅为67.0%。大多数普通菜豆品种再生十分困难，尤其是大粒品种[32]。本试验研究发现，大粒品种英国红芸豆再生困难，再生芽率最低，为22.2%，而小粒品种细白羊角豆再生芽率最高为94.4%。本研究结果进一步说明不同基因型普通菜豆再生能力差异显著，在后续进行遗传转化试验之前筛选合适的基因型是必要的。细白羊角豆具有较高的再生芽率，此基因型可以作为后续遗传转化研究的受体材料，希望通过农杆菌介导法获得普通菜豆转基因植株，并为后续的基因功能验证奠定基础。