重庆小豆种质资源的遗传多样性分析及白粉病抗性鉴定

龙珏臣，杜成章，张晓春，刘剑飞，王 强，高飞虎，唐科明，陈 红，张继君*

（1.重庆市农业科学院，重庆 401329；2.重庆市永川区粮油作物技术推广站，重庆 402160）

小豆(Vigna angularis)是豆科豇豆属(Vigna)的一个栽培种，除富含蛋白质、维生素和矿质元素等营养物质外，还具有活血、利水等药用价值，是广受欢迎的医食两用作物[1]。我国是小豆原产地[2]，主产区主要分布为东北、华北、黄河中游、江淮下游、华北及江淮流域[3]。播种面积约22.8万hm2，年产量约34.7万t，面积和产量均居世界首位[4]。

白粉病是由白粉菌（powdery mildew）专性寄生引起的一种严重病害，植株受侵染后，表面产生一层白色粉状物，白粉菌广泛分布于世界各地，可侵染多种被子植物，对蔬菜、大田作物、果树和花卉等可造成较大危害[5]。小豆白粉病在各生长阶段均有可能发生，发病初期时，叶片上出现褪绿斑点，而后在叶表面生长出白色菌丝与分生孢子，若田间植株密度大、环境潮湿、通风差、光照弱以及氮肥施用多等，则会迅速导致植株全身附着一层白色粉状物，使植株光合作用受到影响，植株开花不正常或不开花，造成减产，甚至绝收[6]。有学者研究表明，小豆对白粉病抗性受1对基因控制[7]。但目前针对小豆白粉病抗性相关的研究鲜有报道，创制的小豆抗白粉病种质较少，因此，对小豆种质资源进行白粉病抗性评价尤为重要。

“第三次全国农作物种质资源调查与收集”重庆市项目组历时2年（2015和2016）在重庆25个区县，共收集到59份小豆种质资源，并对它们进行了基于表型性状标记的遗传多样性分析，2018—2019年，对这些种质资源开展白粉病抗性鉴定，旨在明确重庆地区小豆的遗传多样性信息及白粉病抗性水平，为进一步挖掘抗病种质和优良基因资源奠定物质和理论基础。

1 材料和方法

1.1 参试材料

本试验中的59份地方小豆品种分属于重庆4个自然生态区（Ⅰ-四川盆地农业自然生态区；Ⅱ-三峡库区平行岭谷农林水复合自然生态区；Ⅲ-秦巴山地常绿阔叶—落叶林自然生态区；Ⅳ-渝东南、湘西及黔鄂山地常绿阔叶林自然生态区）的25个区县。生态区Ⅰ的5份，生态区Ⅱ的23份，生态区Ⅲ的18份，生态区Ⅳ的13份。垂直分布上，分布于海拔200～400 m的占15.3%；400～700 m的占13.6%；700～1 000 m的占25.4%；1 000～1 300 m的占15.3%；1 300～1 600 m的占25.4%；1 600 m以上的占5.1%（图1）。

图1 重庆小豆种质资源各收集地坐标及海拔高程Figure 1 Coordinates and elevations of collection sites of Adzuki bean germplasm resources in Chongqing

1.2 试验设计

表型于2017—2018年在重庆市武隆区试验基地（经度107.648535°E，纬度29.521470°N，海拔1 280 m，年平均温度14.8℃，年降水量1 260 mm）进行，每份材料种8行，行长2.5 m，行距50 cm，株距10 cm，3次重复。性状调查按照《小豆种质资源描述规范与数据标准》进行记载[8]，调查开花期、成熟期、主茎色、花色、复叶叶色、复叶叶形、叶柄色以及叶脉色。成熟后考种记载株型、结荚习性、生长习性、荚形、粒形、粒色、株高、底荚高度、分枝数、主茎节数、单株荚数、单荚粒数、荚长、荚宽以及百粒重等性状。

于2018—2019年连续两年在武隆基地开展白粉病抗性鉴定。行长2.5 m，行距50 cm，株距10 cm，每行两端种植1穴武隆当地感病品种为发病株。统计方法参照喻少帆等[9]，0级：无病斑；1级：有少量病斑，病斑覆盖面积占叶片总面积≤12%；2级：病斑覆盖面积占叶片总面积12%

1.3 数据分析

分别对主茎色等11个质量性状进行评价，其中于开花期进行记载，生长习性、结荚习性、荚形、粒色和粒形于成熟期考种记载，并对各质量性状之间的差异用阿拉伯数字进行赋值（表1）。

表1 质量性状赋值Table 1 Quality character assignment

对开花期等11个数量性状进行10级分类处理，第1级[Xi

利用Microsoft Excel软件计算病情指数（DI）和病情进展曲线下面积（AUDPC）[16]，病情指数(DI)=Σ(各级病叶数×各级代表值)/(调查总叶数×最高级代表 值)；病情进展曲线下面积其中n为调查总次数，Xi为第i次调查时的DI，ti为第i次调查时间。抗性评价标准：抗性评价按病情指数划分，高抗(HR)：0

2 结果与分析

2.1 遗传多样性分析

对59份栽培小豆资源的22个性状进行遗传多样性分析（图2、表2），结果表明重庆地区小豆种质资源种内变异较大，平均多样性指数为1.392。其中株高的多样性指数最大，为2.27。各性状多样性指数排序为：株高>成熟期>底荚高度>单株荚数>荚长>百粒重>开花期>荚宽>主茎节数>单荚粒数>分枝数>粒色>荚形>粒形>复叶叶色>生长习性>结荚习性>花色>复叶叶形>主茎色>叶脉色>叶柄色。

图2 59份参试材料的遗传多样性分析Figure 2 Genetic diversity analysis of 59 accessions

表2 59份小豆种质资源信息Table 2 The information of 59 adzuki bean germplasm resources

参试材料各性状之间遗传多样性差异明显。复叶叶色以绿色为主，占50.85%，其次是浅绿占32.2%，深绿最少，占16.95%。复叶叶形以心形居多，占62.71%，卵圆占37.29%。叶脉色以绿色为主，占83.05%，紫色占16.95%。株型直立占多，为59.32%，半蔓生为40.68%。荚形以弓形占比最大，为44.07%，其次是圆筒形，占30.51，镰刀型占比较小，占25.42%。粒色以红色和黄色占比较大，分别为38.98%和33.9%，白色次之，为23.73%，绿色种皮资源最少，仅有2份。

2.2 聚类分析

基于22个性状的聚类分析，将59份参试材料分为5个类群（图3），其中，第Ⅰ类群包含16份材料，主茎色以绿色为主，花色多数为浅黄，复叶叶色绿，复叶叶形多为卵圆，叶柄色和叶脉色均以绿色为主，生长习性多为半蔓生，结荚习性无限，荚形以镰刀形为主，粒色显著区别于其余类群多为白色，粒形以短圆柱为主，株高平均为104.4 cm，百粒重平均为8.2 g。

图3 59份种质资源基于表型数据的UPGMA聚类图Figure 3 UPGMA dendrogram based on phenotypic characters of the 59 adzuki bean genotypes

第Ⅱ类群共包含4份材料，主茎色以绿色为主，花色多数为黄色，复叶叶色浅绿，复叶叶形多为心形，叶柄色和叶脉色均以紫色为主，生长习性多为半蔓生，结荚习性无限，荚形是5个类群中唯一以圆筒形为主的类群，粒色多为黄色，粒形区别于其他类群，以球形为主，株高平均为88.6 cm，百粒重9.0 g。

第Ⅲ类群共包含2份材料，主茎色绿带紫，花色区别于其他类群为浅黄，复叶叶色深绿，复叶叶形多为卵圆，生长习性半蔓生，结荚习性无限，荚形镰刀形，粒色黄色，粒形均为短圆柱形，株高是5个类群中最高的，平均为113.9 cm，百粒重最小，平均为7.6 g。

第Ⅳ类群共包含31份材料，主茎色以绿色为主，花色多数为黄色，复叶叶色绿，复叶叶形多为心形，叶柄色和叶脉色均以绿色为主，生长习性是五个类群中唯一以直立为主的类群，结荚习性多为有限，荚形以弓形为主，粒色多为红色，粒形以短圆柱形为主，株高最低，平均为72.2 cm，百粒重9.4 g。

第Ⅴ类群共包含6份材料，主茎色多为绿带紫，花色多数为黄色，复叶叶色绿，复叶叶形多为心形，叶柄色和叶脉色均以绿色为主，生长习性多为半蔓生，结荚习性以无限为主，荚形以弓形为主，粒色多为红色，粒形以短圆柱形为主，株高84.5 cm，百粒重9.0 g。

表3 各类群部分性状主要表现Table 3 Average expression of part of the characters of the group

2.3 主成分分析

对59份小豆地方品种的22个性状进行的主成分分析，结果显示（表4），前5个主成分的贡献率分别为：18.468、10.224、9.129、8.322和6.288，累计贡献率为52.432%。其中，第一主成分（PC1）特征值为4.063，特征向量中株型、株高、结荚习性和底荚高度的载荷较高，分别为0.429、0.423、0.402和0.303，这表明PC1代表了株型生长等相关性状。

表4 前五个主成分的特征值和特征向量Table 4 Eigenvalues and eigenvectors of the first five principal components

第二主成分（PC2）特征值为2.249，特征向量中单株荚数和单荚粒数的载荷较高，分别为-0.411、-0.323，这表明PC2代表了与荚生长相关的性状。

第三主成分（PC3）特征值为2.088，特征向量中叶柄色和叶脉色的载荷较高，分别为0.301、0.352和0.343，这表明PC3代表了植株叶片颜色相关的性状。

第四主成分（PC4）特征值为1.831，特征向量中粒色的载荷较高，为0.428。第五主成分（PC5）特征值为1.383，特征向量中花色的载荷较高，为0.558。

根据主成分分析结果，利用22个性状的前三个主成分得分绘制三维散点图（图4），图像显示59份参试材料的散点被PC1大致分为了两个区域。分布在图像左侧的参试材料多为直立型且有限结荚习性的材料，而分布在图像右侧的参试材料多为半蔓生型和无限结荚习性的材料。

图4 重庆59份小豆地方品种的三维主成分（PCA）散点图Figure 4 Three-dimensional PCA scatter plot of the 59 genotypes

2.4 白粉病抗性鉴定

连续两年田间抗病鉴定结果显示（表5），59份参试材料的白粉病抗性较差，平均病情指数（DI）为57.5%，处于感病水平。从中筛选出高抗材料6份，抗病材料4份。高抗材料较抗病材料更多，其余材料的白粉病抗性均较差，中感材料12份，感病材料19份，高感材料18份。白粉病抗性最高的是ZY-38，收集自奉节县，病情指数为9.43%，病情进展曲线下面积（AUDPC）为7.022，而收集自渝北的ZY-27的AUDPC仅为4.837，这表明，虽然ZY-38对白粉病抗性总体抗性最高，但ZY-27在受侵害后病情发展最缓慢。这两份资源均能作为极端抗病材料加以利用。

表5 59份小豆种质资源两年平均白粉病抗性Table 5 Resistance to powdery mildew of 59 adzuki bean germplasm resources

3 讨论

重庆地区特别是秦巴山区和武陵山区地形陡峭，平坡土稀少，农作物种植劳动强度大，同时，随着城镇化发展加速农村劳动力大量脱离农村，留守农村并继续从事传统农业的人口年龄也在逐年增长，本研究调查中发现，重庆地区小豆地方品种面临着种植面积萎缩，在地方品种种植数量逐年减少的问题，然而种质资源是作物遗传改良的物质基础，对种业发展和优良品种的选育有重要意义[17]。因此，加大种质资源收集力度，是保护小豆种质资源的关键。白鹏等[18]对全国18个省区市的257份小豆种质资源进行了遗传多样性分析，其结果表明，全国小豆种质资源遗传多样性丰富。多样性系数最高的是株高、花蕾色以绿色为主、粒形以短圆柱为主、主茎色以绿色为主，以上结果与本研究中的相一致，但重庆地区的小豆品种籽粒色以非红色为主。重庆小豆地方品种数量性状多样性指数平均为1.989，与全国水平相当，这表明经过长期的驯化，表型性状上并未发生明显变异，而留种习惯上重庆地区老百姓更偏好非红色籽粒的品种。

聚类分析中，第Ⅳ类群的材料多为株型直立，结荚习性有限，株高适中，底荚高度适中，适宜机械化生产，同时百粒重较大，具备良好的商品性，可做籽粒型商品种开发利用。第Ⅰ类群、第Ⅱ类群和第Ⅴ类群的材料的株高偏高，结荚习性以无限为主，改良其株型性状后可作为白豆沙专用型材料进行开发。主成分分析结果显示，前三个主成分将参试材料大致划分为两个区域，且这两个区域的地方品种在地理分布上并未呈现一定的聚集，这与聚类分析的结果相印证。

喻少帆等[9]的筛选到高抗材料14份，占参试材料总数的2.8%，本研究从重庆地区的种质资源中筛选出6份高抗材料，占总数的10.1%，这表明重庆地区地方品种中高抗材料的比例是高于北方品种的。遗憾的是重庆地区小豆地方品种未筛选到免疫品种。本研究中，采用感病品种诱导田间发病，更好地模拟了自然发病条件，但采用室内人工接种可提供更高的选择压力，从而缩短选择周期，因此在进一步的抗病品种筛选中，应在诱导田间发病基础上结合室内接种鉴定，以获取更优良的抗病材料。

4 结论

重庆地区的小豆种质资源在空间分布上种内基因交流频繁，并未发生明显的种内变异，同时与重庆以外其他地区的种质交流同样频繁，这表明，重庆地区老百姓在小豆种质的驯化过程中，并未进行过多干预，很好地保留了小豆地方品种的原始状态，在今后的种质资源研究工作中，应加大对重庆地区小豆种质资源的收集和保护力度。收集自第Ⅱ生态区的P500112012号品种的病情进展曲线下面积最小，收集自第Ⅲ生态区2015502404号品种的病情指数最低，这两个品种均为白粉病高抗材料，可作为亲本材料用于小豆白粉病抗病育种。