特发性膜性肾病患者肾小球IgM沉积情况及其与临床病理特征的关系分析

夏虹 马书云 张文 张培培 陈雨婷 陈红波 马红珍

特发性膜性肾病（idiopathic membranous nephropa‐thy,IMN）是一种以肾小球足细胞为抗原介导的免疫性疾病，最终导致免疫复合物形成并沉积于基底膜、补体激活和大量蛋白尿[1]。目前已确定的IMN靶抗原包括磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor,PLA2R）、血小板反应蛋白7A（thrombospondin domain-containing 7A,THSD7A）、神经表皮生长因子样1蛋白（neural epi‐dermal growth factor-like 1 protein,NELL-1）、神经细胞黏附分子1（neural cell adhesion molecule 1,NCAM-1）、信号肽3B（semaphorin 3B,SEMA3B）、高温重组蛋白A1（high temperature recombinant protein A1,HTRA1）、原钙黏附蛋白（protocadherin 7,PCDH7）以及未知抗原（5%～10%）[2]。IMN病理特点是免疫球蛋白G（immunoglobu‐lin G,IgG）呈颗粒状沉积于基底膜上皮侧，多数患者可伴有补体系统成分沉积，少数患者同时可见免疫球蛋白M（immunoglobulin M,IgM）和免疫球蛋白A（immu‐noglobulin A,IgA）沉积。抗PLA2R抗体和抗THSD7A抗体以IgG4亚类为主[3-4]，NELL-1相关IMN患者产生的最丰富的IgG亚类是IgG1[5]。目前也有证据证明补体激活是IMN发病的潜在机制[6-7]。而部分IMN患者存在的肾小球IgM沉积是否参与IMN的发病以及对其临床病理特征及转归是否存在影响目前尚未完全明确。基于此，本研究回顾性分析IMN患者伴肾小球毛细血管襻IgM沉积的临床病理特征，探讨IgM沉积在IMN中的临床意义，现报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2017年5月至2022年2月浙江中医药大学附属第一医院收治的IMN患者133例，均经肾穿刺活检确诊。其中男73例，女60例，男女比例1.2∶1。纳入标准：（1）肾穿刺活检诊断为IMN，且光镜下每个切面肾小球数目＞10个，免疫荧光下肾小球数目＞3个；（2）病理免疫荧光染色显示毛细血管襻IgG沉积++或以上。排除标准：排除肿瘤、风湿免疫性疾病（如系统性红斑狼疮、干燥综合征、类风湿关节炎、抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎等）、感染性肾炎（如乙肝相关性肾炎、丙型肝炎、梅毒等）、明确肾毒性用药史或重金属暴露史、糖尿病肾病等已知继发性膜性肾病患者。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 （1）患者基本信息：年龄、性别、病程（指从出现肾病相关症状如浮肿，或从明确检查出尿检异常及肾功能异常到肾穿刺活检时）、高血压病史、基础血压。（2）实验室检查资料：入院肾穿刺活检当日时或肾穿刺活检前1周内清晨空腹检查时的24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、血尿酸、估算的肾小球滤过率（eGFR）、血浆白蛋白、血清TC、TG、LDL、IgA、IgM、IgG 和补体 3（complement 3,C3）、C4水平。eGFR采用EPI公式计算。高血压定义为在未用降血压药物情况下，既往或住院期间存在2次或2次以上收缩压≥140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和（或）舒张压≥90 mmHg。（3）肾穿刺后相关资料：随访时间（从肾穿刺活检时开始计算）、是否使用免疫抑制剂、缓解情况及检验资料。

1.2.2 治疗方案 根据IMN患者肾功能进展分层风险决定具体治疗方案，包括仅仅观察及评估，或给予利妥昔单抗、钙调磷酸酶抑制剂、环磷酰胺、糖皮质激素等单药或联合用药治疗方案[8]。

1.2.3 病情缓解标准 患者24 h尿蛋白量≤0.3 g、血清白蛋白水平≥35 g/L定义为完全缓解；24 h尿蛋白量＞0.3 g且＜3.5 g，较基线水平下降≥50%，且血清白蛋白水平≥30 g/L，定义为部分缓解；否则定义为未缓解[9]。

1.2.4 肾组织处理及病理观察指标 经患者肾穿刺活检获得的肾组织经石蜡包埋，切片厚度约1.5～2 μm，行HE染色、糖原（periodic acid-schiff,PAS）染色、过碘酸六胺银染色（periodic acid-silver metheramine,PASM）和马松（Masson）染色；肾组织经OCT包埋后，制作冷冻切片，厚度约4～5 μm，按照标准流程进行免疫荧光染色；将染色好的光镜切片及冷冻切片分别进行光学显微镜和免疫荧光显微镜检查。采用半定量法记录免疫荧光沉积强度，0、+、++、+++、++++代表荧光强度从阴性到最强，记录为0、1、2、3、4，≥0.5+（±）即定义为阳性。肾小管萎缩程度记录方法：0、+、++、+++代表肾小管萎缩面积从小到大，记录为0、1、2、3，0表示萎缩面积≤5%，1表示萎缩面积＞5%且≤25%，2表示萎缩面积＞25%且≤50%，3表示萎缩面积＞50%。

1.3 观察指标 根据IMN患者肾小球IgM是否沉积分为IgM阳性组与阴性组。（1）比较IgM阳性组与IgM阴性组患者临床病理特征；（2）分析IMN患者IgM沉积情况与临床病理特征的相关性；（3）比较IgM阳性组与IgM阴性组患者IgG亚型、PLA2R及THSD7A沉积情况；（4）分析IMN患者IgM沉积情况与IgG1沉积强度的相关性；（5）比较IgM阳性组与IgM阴性组患者预后；（6）分析IMN患者疾病未缓解的危险因素。

1.4 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。正态分布的计量资料以表示，组间比较采用两独立样本t检验；不符合正态分布的计量资料以用M（P25，P75）表示，组间比较采用Wilcoxon秩和检验。计数资料以频数和构成比表示，组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman秩相关。采用Kaplan-Meier生存分析分析两组患者疾病缓解情况；IMN患者疾病未缓解的危险因素分析采用Cox回归。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 IgM阳性组与IgM阴性组患者临床病理特征比较 IgM阳性组患者97例（72.9%），阴性组患者36例（27.1%）。阳性组男性患者占比大于IgM阴性组（P＜0.05），血清TG水平低于IgM阴性组（P＜0.05）。两组患者年龄、病程、收缩压、舒张压、高血压病史、肾穿刺前使用过免疫抑制剂占比、24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮、血尿酸、eGFR、血清白蛋白、血清TC、TG、LDL、血IgA、血IgM、血IgG、血C3及血C4等指标比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。IgM阳性组IgG、C3沉积强度均高于IgM阴性组（均P＜0.05）。两组患者肾小球球性硬化比例、肾小管萎缩程度、IgA沉积强度及C1q沉积强度比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 IgM阳性组与IgM阴性组患者临床病理特征比较

2.2 IMN患者IgM沉积与否与临床病理特征的相关性分析 分析133例IMN患者的性别分布、血清TG水平、IgG沉积强度、C3沉积强度与IgM沉积与否的相关性，结果显示IMN患者肾小球IgM沉积与血清TG水平呈负相关（P＜0.05），与其余指标未见明显相关性，见表2。

表2 IMN患者IgM沉积与否与临床病理特征的相关性分析

2.3 IgM阳性组与IgM阴性组患者IgG亚型、PLA2R及THSD7A沉积强度比较 133例IgM患者中68例完成了IgG亚型、PLA2R及THSD7A的免疫荧光检查，其中THSD7A均为阴性。IgM阳性组与IgM阴性组患者IgG1沉积强度差异有统计学意义（P＜0.05），而IgG2、IgG3、IgG4、PLA2R沉积强度比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。

表3 IgM阳性组与IgM阴性组患者IgG亚型、PLA2R及THSD7A沉积强度比较

2.4 IMN患者IgM沉积与否与IgG1沉积强度的相关性分析 Spearman秩相关分析IgG1沉积强度与IgM沉积与否的相关性，结果显示IMN患者IgM沉积与IgG1沉积强度呈正相关（r=0.269，P＜0.05）。

2.5 IgM阳性组与IgM阴性组患者预后比较 133例患者中72例患者随访资料完整，随访时间为肾穿刺活检后6.7（5，12）个月，包括IgM阳性组51例、阴性组21例。其中20例（27.78%）完全缓解，19例（26.39%）部分缓解，33例（45.83%）患者未缓解。采用Kaplan-Meier生存分析比较两组患者累积缓解率，差异无统计学意义（Breslowχ2=2.144，P＜0.05）。见图1。

图1 IgM阳性组与IgM阴性组患者累积缓解率比较（Kaplan-Meier生存分析）

2.6 IMN患者疾病未缓解危险因素分析 将疾病未缓解定义为结局事件，单因素Cox回归分析显示，有高血压病史、血清TG水平、肾小管萎缩程度与IMN患者疾病未缓解相关。进一步多因素Cox回归分析显示，血甘油三酯水平高、肾小管萎缩程度重是IMN患者疾病未缓解的独立危险因素（均P＜0.05）。见表4。

表4 IMN患者疾病未缓解危险因素分析

3 讨论

本研究结果显示，IMN患者中IgM阳性组男性居多，且具有较低的血清TG水平，且IgM沉积与TG水平呈负相关。Kaplan-Meier生存分析发现IgM阳性组和IgM阴性组之间的肾脏累积缓解率无统计学差异，这与Xu等[10]的研究结果一致，该项研究中还提到IgM沉积是每年eGFR下降≥5 ml/（min·1.73 m2）的独立危险因素。本研究只探讨了IgM沉积对肾脏缓解率的影响，没有在随访过程中对肾功能进展进行单独的分析。本研究发现IgM沉积不是IMN患者疾病缓解的独立危险因素，其临床意义还需要更多的大样本、多中心研究进一步验证。本研究没有发现IgM阳性组与IgM阴性组患者血清IgM水平存在差异，而有研究表明IgM肾病患者的血清IgM水平更高[11]，提示两种疾病发病机制的差异性。

IgM是初次体液免疫应答早期阶段产生的主要免疫球蛋白，它的分子量是五类免疫球蛋白中最大的，同时也是人体循环系统中最大的抗体。IgM可激活补体经典途径，是补体级联反应的初始激活剂。除了IgG，IgM沉积于IMN患者的毛细血管襻也比较常见。肾小球内其他类型免疫复合物（IgM、IgA、C1q）的沉积通常被认为是继发性膜性肾病的特征[12]。然而在临床实践中，笔者发现许多抗PLA2R抗体阳性的IMN患者肾小球内也有IgM沉积。本组患者中IgM沉积阳性率高达72.93%，潜在的机制及意义不能通过是血液中的IgM外渗通过肾小球滤过屏障而沉积这一简单的假设来完全解释。Panzer等[13]在小鼠非硬化性和非免疫性复杂肾小球疾病模型中，鉴定出与肾小球表位结合并促进肾小球损害进展的特异性IgM抗体。Strassheim等[14]在阿霉素诱导的局灶节段性肾小球硬化的动物模型中发现，低渗休克耗竭腹膜B细胞可以在不影响血清总IgM的情况下阻止肾小球IgM的沉积。本研究发现IgM阳性组IgG和C3沉积情况存在差异，尽管两者与IgM沉积与否无明显相关性，进一步IgG亚型分析提示IgM沉积与IgG1沉积强度呈正相关。这提示IgM和补体介导的损伤可能是原发性肾脏遭受攻击后发生的继发性现象。

目前已经明确的与IMN病理生理学机制有关的抗原的抗体除了IgG4，还有IgG1。从抗PLA2R-Ab阳性的原发性膜性肾病患者中纯化的IgG4在体外发现能结合凝集素，诱导人足细胞细胞骨架改变[15]。尽管IgG4不能通过经典途径有效地激活补体，但几乎100%的IMN患者存在C4d沉积[16]。血浆补体激活片段的测定进一步表明，补体系统在IMN患者中被激活[17]。这进一步提示IMN中补体经典途径同样被激活，上述已经提到IgM可激活补体经典途径，这可能意味着IgM激活的补体经典途径在IMN也发挥了一定的作用，是否存在IgM针对的足细胞抗原，需要研究者大胆的假设和验证。

本研究发现使用免疫抑制剂治疗不是影响肾脏预后的独立危险因素，且肾穿刺前使用免疫抑制剂对IgM沉积与否没有影响。Kanemoto等[18]在一项研究中评估了IgM对特发性肾病综合征转归的意义，该研究包括105例患者（IgM沉积阳性30例、沉积阴性40例），不论特发性肾病综合征是何种病理亚型，研究认为IgM沉积与类固醇耐药有关。本研究样本量有限，相关的结果需要多中心、前瞻性研究去验证。

综上所述，肾小球IgM沉积与否与IMN患者的临床病理特征有一定相关性。IgM沉积不是疾病缓解的独立危险因素。笔者推测IgM可能与肾小球损伤的抗原表位结合，通过激活补体系统参与IMN发生、发展。