脂多糖通过诱导NLRP3表达促进膀胱癌细胞侵袭迁移的机制研究

易永祥 唐晨野 沈瑞林 郭晓 汤志灵

炎症与肿瘤关系密切，目前认为由细菌或病毒感染引起的炎症可能会促进肿瘤发生，同时在肿瘤发展的大多数阶段也可能起着关键作用，包括增殖、血管生成和侵袭转移等[1]。炎症在膀胱癌（bladder cancer,BC）发生和进展过程中同样被认为是一种重要的因素[2]，但其内在机制尚未完全阐明。脂多糖（lipopoly‐saccharide,LPS）是革兰阴性杆菌细胞壁的组成成分，是一种致炎因子，其通过作用于配体Toll样受体4（toll-like receptor 4,TLR4）促进细胞内NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（nucleotide binding oligomeriza‐tion-like receptor family pyrin domain containing 3,NL‐RP3）基因转录，从而发挥生物学活性。本研究通过观察LPS及NLRP3的特异性抑制剂MCC950对BC5637细胞增殖活力、侵袭迁移及相关因子表达的影响，来阐释炎症在BC发展过程中一种潜在的作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料 人BC5637细胞购自中国科学院上海细胞库；LPS（LPG-38-01）购自深圳欣博盛生物科技有限公司；MCC950（HY-12815）购自美国 MCE 公司；CCK-8试剂盒（40203ES60）、RT-PCR试剂盒（11202ES08）购自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；Transwell侵袭小室（3422）购自美国Corning公司；NLRP3（19771-1-AP）、基质金属蛋白酶-2（matrix metallopeptidase-2，MMP-2）（10373-2-AP）、基质金属蛋白酶-9（matrix metallopeptidase-2，MMP-9）（27306-1-AP）、钙黏蛋白E（E-cadhjerin）（20874-1-AP）、波形蛋白（Vimentin）（10366-1-AP）、GAPDH（10494-1-AP）抗体均购自于美国proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将冻存的5637细胞于37℃水浴融化后移入EP管，离心后取上清液，加入新鲜RPMI1640完全培养基（含10%FBS），置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，待细胞生长至对数期时，用于后续实验。

1.2.2 实验分组及处理 将生长至对数期的5637细胞按50×104个/孔接种至6孔板中，当细胞贴壁生长且汇聚达到80%时加入不同药物，分为4组，分别为LPS组、MCC950组、LPS/MCC950组及空白对照组。药物浓度为 LPS（100 μg/ml）、MCC950（1 μmol/L），药物作用时间12 h，然后分别提取各组细胞进行实验。

1.2.3 CCK-8实验 将4组细胞分别按5×103个/孔种植在96孔板中，每孔加入90 μl培养基，继续置于5% CO2、37 ℃培养箱中培养，分别于第24、48、72、96 h时采用酶标仪检测选定孔的450 nm处光密度（optical density,OD）值，OD值可反映细胞增殖活力，检测前2 h需加入CCK-8溶液。

1.2.4 Transwell侵袭实验 将Matrigel基质胶提前1 d铺在Transwell小室内，放置于37℃培养箱内待用。收集4组细胞，调整细胞浓度为5×104个/ml，接种100 μl细胞悬液于Transwell小室内，24 h后取出小室并用PBS清洗2遍，加入4%甲醛溶液室温固定20 min，PBS清洗3遍，结晶紫染色5 min，用棉签去除小室内细胞，PBS再次清洗2遍，晾干后采用倒置显微镜随机选择5个视野拍照并计算细胞侵袭数目。相对侵袭率=观察组细胞侵袭数/对照组平均细胞侵袭数×100%。

1.2.5 细胞划痕实验 将4组细胞分别按104个/孔种植于24孔板中，用25 μl的消毒枪头从上至下在24孔板中央做垂直划痕，再用无血清PBS清洗3遍以除去划下的悬浮细胞，分别在划痕后即刻及24 h采用倒置显微镜观察细胞的迁移情况并拍照。应用Image-Pro Plus 6.0软件测量两个时间点细胞未覆盖的面积。划痕愈合率=[1-（24 h的划痕面积/开始的划痕面积）]×100%。

1.2.6 qRT-PCR 按照TRIzol法的相关步骤分别提取4组细胞的总RNA，进行RNA纯度和完整度鉴定并取500 ng进行逆转录，将取得的cDNA用作实时定量PCR的模板。设计并合成MMP-2、E-cadherin、Vimentin、NLRP3及内参照GAPDH的引物序列详见表1。在ABI7500（Applied Biosystems）PCR仪上进行操作，采用RQ=2-ΔΔCt法计算上述基因的相对表达量。

表1 各基因的引物序列

1.2.7 Western blot 使用RIPA裂解液分别提取4组细胞的总蛋白，紫外分光光度计测定蛋白浓度，将蛋白样品与SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合后上样，经过转膜及5%脱脂牛奶+TBST封闭，加入一抗稀释液，4℃杂交过夜，PBS清洗3遍后加入二抗稀释液室温孵育1 h，滴加化学发光液后显影、扫描，对感光胶片条带进行灰度值测定，以目的条带与内参照条带GAPDH的比值代表目的蛋白的相对表达量。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，GraphPad Prism 6.0软件进行统计作图。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，多重比较采用Tukey检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPS和MCC950对5637细胞增殖活力的影响 图1和表2显示，在24、48、72、96 h 4个时间点，4组之间的OD值均不全相同或全不相同，差异有统计学意义；LPS组的OD值均显著高于空白对照组和MCC950组，MCC950组在24、48 h两个时间点的OD值显著低于空白对照组；LPS/MCC950组在4个时间点的OD值均显著低于LPS组。LPS增强5637细胞增殖活力的作用可被MCC950抑制，说明LPS可能通过刺激NLRP3表达来增强5637细胞的增殖活力。

图1 CCK-8实验检测LPS和MCC950对5637细胞增殖的影响

表2 4组细胞各时间点的450 nm OD值比较

2.2 LPS和MCC950对5637细胞侵袭能力的影响 空白对照组、LPS组、MCC950组、LPS/MCC950组的相对侵袭率分别为（100.00±14.43）%、（150.00±8.33）%、（100.00±22.05）%、（111.10±9.62）%，总体上具有统计学差异（F=7.89，P＜0.01）。图2显示，LPS组的侵袭率显著高于空白对照组和MCC950组；LPS/MCC950组的侵袭率显著低于LPS组。LPS促进5637细胞侵袭的作用可被MCC950抑制，说明LPS可能通过刺激NLRP3表达来增加5637细胞的侵袭能力。

图2 Transwell侵袭实验检测LPS和MCC950对5637细胞侵袭能力的影响（a：结晶紫染色，×10；b：4组间相对侵袭率的两两比较，*P＜0.05）

2.3 LPS和MCC950对5637细胞迁移能力的影响 空白对照组、LPS组、MCC950组、LPS/MCC950组的24 h划痕愈合率分别为（50.23±1.95）%、（60.87±1.99）%、（39.82±2.89）%、（48.27±0.64）%，总体上具有统计学差异（F=54.40，P＜0.01）。图3显示，LPS组的划痕愈合率显著高于空白对照组和MCC950组；MCC950组的划痕愈合率显著低于空白对照组；LPS/MCC950组的划痕愈合率显著低于LPS组并高于MCC950组。LPS促进5637细胞迁移的作用可被MCC950抑制，说明LPS可能通过刺激NLRP3表达来增加5637细胞的迁移能力。

图3 细胞划痕实验检测LPS和MCC950对5637细胞迁移能力的影响（a：细胞划痕图，×4；b：4组间24 h划痕愈合率的比较，**P＜0.01）

2.4 LPS和MCC950对5637细胞侵袭迁移、上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）相关因子及NLRP3表达的影响 4组的MMP-2、E-cadherin、Vimentin、NLRP3 mRNA相对表达量均不全相同或全不相同，差异有统计学意义（F=109.80、6.63、133.50和9.67，均P＜0.05）。图4显示，LPS组的 MMP-2、Vi‐mentin、NLRP3 mRNA表达量均显著高于空白对照组和MCC950组，E-cadherin mRNA表达量则显著低于空白对照组和MCC950组；MCC950组的MMP-2 mRNA表达量显著低于空白对照组；LPS/MCC950组的MMP-2、Vimentin、NLRP3 mRNA表达量显著低于LPS组，E-cadherin mRNA表达量则显著高于LPS组。4组的MMP-2、MMP-9、E-cadherin、Vimentin、NLRP3蛋白相对表达量均不全相同或全不相同，差异均有统计学意义（F=9.72、41.26、190.60、224.30和38.23，均P＜0.05）。图5显示，LPS组的MMP-2、MMP-9、NLRP3蛋白表达量均显著高于对照组和MCC950组，E-cadherin蛋白表达量则显著低于对照组和MCC950组；MCC950组的MMP-2、MMP-9、Vimentin、NLRP3蛋白表达量均显著低于对照组，E-cadherin蛋白表达量则显著高于对照组；LPS/MCC950组的MMP-9、Vimentin、NLRP3蛋白表达量均显著低于LPS组，E-cadherin蛋白表达量则显著高于LPS组。LPS可显著上调5637细胞NLRP3 mRNA和蛋白表达，同时影响侵袭迁移及EMT相关因子的表达，但这些效应均可被MCC950抑制，证实LPS可通过诱导NLRP3表达来促进5637细胞侵袭迁移及EMT。

图4 qRT-PCR检测LPS和MCC950对5637细胞侵袭迁移、EMT相关因子及NLRP3 mRNA表达的影响（*P＜0.05，**P＜0.01）

图5 Western blot检测LPS和MCC950对5637细胞侵袭迁移、EMT相关蛋白及NLRP3蛋白表达的影响（a：蛋白条带图；b：4组间各蛋白相对表达量的两两比较，*P＜0.05，**P＜0.01）

3 讨论

LPS可以通过病原相关分子模式（pathogen associ‐ated molecular pattern，PAMP）结合 TLR4/髓样分化蛋白-2复合体触发TLR4信号通路，激活NF-κB，使其组成部分p65出现磷酸化和核易位，进一步触发NLRP3转录并激活NLRP3炎症小体[3-5]，也可以通过激活Cas‐pase-11，切割gasdermin D产生氨基末端片段，以细胞固有的方式激活NLRP3炎症小体[6]，从而引起炎症反应。LPS可用于构建神经炎、肺炎、脓毒症等炎症模型[7-9]，也可用于模拟肿瘤细胞所处的炎症微环境[10-11]。本研究同样采用LPS处理5637细胞以模拟炎症微环境，研究炎症对BC细胞侵袭迁移的影响。

NLRP3蛋白属于NOD样受体（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor,NLR）蛋白家族，由热蛋白结构域（pyrin domain,PYD）、核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide-binding and oligomerization do‐main,NACHT）及富含亮氨酸重复序列（leucine-rich repeats,LRR）3部分组成[12]。NLRP3炎症小体是目前研究最为广泛和深入的炎症小体之一，主要在巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞等炎症和免疫相关的细胞中表达，也可在多数肿瘤细胞中表达[13]，其可介导IL-1β、IL-18等促炎细胞因子分泌，在调节炎症反应和免疫微环境中发挥重要的作用[14]。通过调控NLRP3观察BC细胞侵袭迁移能力的变化可以很好地阐明炎症影响BC进展的一种可能的机制。

本研究表明LPS可显著增强5637细胞的增殖活力，促进其侵袭迁移及EMT，同时本研究也观察到NL‐RP3 mRNA和蛋白表达上调，据此推测在炎症微环境中BC细胞的侵袭及迁移能力增加，而其中NLRP3炎症小体可能发挥着重要的作用。本研究采用MCC950处理5637细胞，发现NLRP3蛋白的表达被显著抑制。MCC950是一种含有二芳基磺酰脲的化合物，可以直接与NLRP3的NACHT结构域内的Walker B基序相互作用，从而阻断ATP水解并抑制NLRP3活化及炎症小体形成，而且对NLRP1、NLRC4、AIM2等其它炎症小体的激活没有影响，因此MCC950被认为是NLRP3的强效特异性抑制剂[15-16]。本研究将MCC950与LPS共同作用于5637细胞，发现MCC950可显著抑制LPS对5637细胞产生的效应，这就证实了LPS可通过诱导NLRP3表达来促进BC细胞侵袭迁移的机制。

近年来，许多研究同样表明NLRP3炎症小体具有促进肿瘤侵袭转移的作用。在结直肠癌中，肿瘤周围组织的巨噬细胞高表达NLRP3，激活NLRP3可增强结直肠癌细胞的体外迁移和体内转移能力[17]。在食管癌中，NLRP3与Ki-67增殖指数呈正相关，过表达NLRP3显著促进肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移，而沉默则产生相反效应[18]。在乳腺癌中，NLRP3在高侵袭亚型中表达异常上调，且可以通过Caspase-1依赖的方式诱导IL-1β自分泌以促进EMT和转移[19]。由于NLRP3炎症小体在肿瘤发生、发展过程中的作用逐步得到证实，目前已作为潜在的抗肿瘤治疗靶点受到关注[20]。

综上所述，本研究采用LPS处理BC细胞以模拟炎症微环境，发现LPS可通过诱导NLRP3表达来促进BC细胞侵袭与迁移。NLRP3炎症小体可能是炎症状态下促进BC进展的重要因子。我们还需通过动物实验和进一步的机制研究加以论证。