山定子种子冻干处理与层积处理解除休眠的比较试验*

杨 锋，郭洪涛，闫忠业，黄金凤，刘 志

（1 辽宁省果树科学研究所，营口115009）（2 熊岳金和苗木经销处）

苹果（Malus pumilaMill.）属蔷薇科苹果属，原产于欧洲中部、东南部、中亚及我国新疆[1]，在全世界栽培面积较广，产量较多。2020 年，我国苹果栽培面积208.852 万hm2，产量4 406.6 万t，分别占世界苹果总面积的44.3%、总产量的50.5%[2]，年产值2 100 亿元，是我国农业经济的重要组成部分。苹果是多年生木本植物，其良种繁殖依赖于嫁接、扦插等无性技术以保持种性的纯度[3]。山定子（Malus baccata（L.）Borkh.）为苹果属落叶乔木，原产于亚洲东北部，在我国的新疆、河北和东北山区以及川西高原等地均有分布，抗寒性极强，容易繁殖，是苹果苗木常用的基砧[4]。但山定子种子需要经过一定的低温处理才能解除休眠，生产上通常使用层积解除种子的休眠，以提高出苗率和整齐度[5]。山定子种子层积受植物激素、化学物质、环境条件、逆境胁迫、贮藏年限等多种因素的影响[6-7]，传统层积法是采用沙藏数周，其间温、湿度不易控制，容易干燥、发热、霉烂或招致鼠害等，影响发芽；且一旦解除休眠，种子在层积坑中很快发芽，必须及时播种，否则会降低发芽率，不易控制播种时间，给春耕带来诸多不便[8]。为克服上述不足、降低育苗成本，我们研究了山定子种子冻干处理技术，于2014 年获发明专利“山定子层积方法”（ZL 2012 1 0078198.6）。

1 材料与方法

1.1 试验材料

山定子果实采自辽宁省果树科学研究所苹果砧木育种试验区，11 月中旬采摘充分成熟、无病虫害的山定子果实，放于缸中15 d，果肉后熟腐烂，用清水反复漂洗，清除果肉，种子摊开，自然晾干，去除果柄、杂质及干瘪种子后，在室内通风处贮藏待用。

1.2 试验处理

试验设3 个处理：山定子种子冻干处理，山定子种子层积处理，以在室内通风处放置的未处理山定子种子作为对照。

（1）冻干处理。12 月中下旬，将山定子种子在40～50 ℃的温水中浸泡12 h，捞出后装入网袋中，在室外背阴处-15～-5 ℃下冷冻处理15 d，自然冻干，然后在报纸上摊开，自然晾干后在纸袋或编织袋中保存，0～15 ℃条件下贮存待用。

（2）层积处理。11 月上旬土壤封冻前，选择背阴处，挖宽0.8 m、深0.6 m 的层积坑。12 月上中旬，将山定子种子与含水量60%的细河沙按1∶5混合均匀，放入网袋或编织袋中，放入层积坑中，用沙土填埋，在中央位置插入玉米秸秆或草把通气；于培土处浇入15 kg 清水，培土堆高于地表30 cm，层积天数50～60 d[9]。

1.3 试验测定项目与方法

（1）种子α-淀粉酶活性。采用二硝基水杨酸法测定α-淀粉酶活性。将处理的山定子种子放入pH值为5.5 的醋酸钠与氯化钙缓冲液中，在冰浴条件下研磨成匀浆，4 000 r/min 离心10 min，取上清液定容至25 mL，制备酶的提取液，然后在70 ℃恒温水浴15 min 钝化β淀粉酶；取1 mL 酶液加入1%淀粉溶液2 mL，在40 ℃水浴5 min 后，用4 mL 0.4 mol/L 的NaOH 终止反应；取反应液2 mL 加入2 mL二硝基水杨酸水浴5 min，定容至25 mL，用分光光度计在520 nm 下测定比色值，将比色值代入麦芽糖标准曲线，求得每克种子的α-淀粉酶活力单位数[10]，酶活性单位为U/g，一个活力单位指在25 ℃最适pH 值与底物充足条件下，每分钟转化1 μmol 底物所需要的酶量[11]。

（2）种子激素含量。委托中国农业大学农学院采用酶联免疫吸附法测定生长素（IAA）、赤霉素（GA）、细胞分裂素（CTK）。称取处理的山定子种子1.0 g，加2 mL 样品提取液，在冰浴下研磨成匀浆，转入10 mL 试管，4 ℃下浸提4 h，1 000 r/min离心15 min，取上清液、过C18 固相萃取柱，再转入5 mL 塑料离心管中，真空浓缩干燥或用氮气吹干，用稀释液溶解定容至1.5 mL。在10 mL 包被缓冲液中加入一定量的包被抗原（最适稀释倍数见试剂盒标签）混匀，在酶标板每小孔中加100 μL；然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内，置于37 ℃下3 h。再经洗板、加标样和抗体、显色、比色等测定出激素含量[12]，单位为ng/g。

（3）种子发芽率与播种出苗率。取处理种子1 000 粒，放于托盘中用湿毛巾覆盖，于20 ℃条件下催芽，其间每12 h 喷水1 次，保持种子湿润。2月中旬温室播种，4 月初露地播种。播种2 周后统计出苗率。

出苗率（%）＝（出苗数/种子数）×100[13]

2 结果与分析

2.1 α-淀粉酶活性分析

种子经过层积处理或其他途径打破休眠后，其内部的酶由束缚型逐渐转变为游离型以用于代谢活动。α-淀粉酶的活性在种子萌芽前后含量水平变化较大，常用于作为种子萌芽活力的评价指标[14]。从图1 可以看出，冻干处理种子α-淀粉酶活性与层积种子的差异不显著，而两者均极显著高于未处理的种子。

图1 不同方法处理的山定子种子的α-淀粉酶活性

2.2 激素含量分析

种子萌芽前激素大量合成，原有固定在胚乳中的束缚型转变为可移动的游离型，并运输到生长旺盛的胚根和胚芽部分促进生长与发育，在促进种子萌芽的激素中，以IAA、GA、CTK 等内源激素最为活跃[15]。从图2 可以看出，冻干处理种子中IAA、GA、CTK 含量与层积处理种子的差异均不显著，但均极显著高于未处理种子。

图2 不同方法处理的山定子种子激素含量

2.3 种子发芽率与播种出苗率

种子经层积处理之后，在温度、湿度、空气等环境适宜的条件下，即可以萌发[16]。生产上在播种前会对种子进行催芽处理，以提高发芽率和出苗的整齐度。从图3 可以看出，冻干处理的种子发芽率为91.9%，层积处理的为93.8%，两者差异不显著，而未处理的种子发芽率仅为24.6%。

图3 不同方法处理的山定子种子发芽率

在温室播种，冻干处理的种子出苗率为87.9%，层积处理的种子出苗率为90.8%；两者田间播种出苗率分别为78.3%、82.7%，两种播种方法2 个处理出苗率差异均不显著。而未处理的种子两种播种方法出苗率分别为19.2%、15.9%（图4）。

图4 不同方法处理的山定子种子温室和田间播种出苗率

3 讨论与结论

优质的苗木是保证果园整齐、果品优质、丰产稳产的前提[17]，沙藏作为常规的层积方法，具有出芽率高、稳定性好的优点，在本试验中山定子种子平均出苗率达到86.8%；冻干处理平均出苗率也达到83.1%，略低于层积的。与层积相比，冻干处理山定子种子在α-淀粉酶活性和IAA、GA、CTK 等激素含量上略小于层积的，其中α-淀粉酶是水解淀粉转化为糊精、麦芽糖、葡萄糖的关键酶，为种子萌芽提供小分子碳水化合物以供胚芽轴的生长[18]，IAA、GA、CTK 等在种子解除休眠后显著增加，在种子萌发过程中起着原初反应的信号作用[19-20]。本试验尝试的冻干处理在温度、时间等方面尚未开展梯度化的精细设计，其能否在酶活性、激素含量、发芽率和出苗率等各项指标上达到或超过沙藏层积，还需要进一步补充完善及筛选优化出最佳的技术方案和参数等。

层积是将种子埋于户外地下的环境，其温度、湿度、时间、时机等并不容易掌控，处理不当容易解除休眠不彻底而发芽率低，或过早打破休眠而于层积坑中发霉、发芽等现象[21]；比较而言，冻干处理更易于掌控温度、湿度、时间等各个环节，作业高效简易可随时监控，符合当前及未来果业轻简省工的发展趋势[22]。

本文以抗性强、耐瘠薄、应用广的山定子为材料开展了冻干处理的简易层积试验，即种子在40～50 ℃的温水中浸泡12 h，于室外背阴处在-15～-5 ℃低温下冷冻处理15 d；种子内α-淀粉酶活性和IAA、GA、CTK 等激素含量均达到了常规层积的水平；发芽率、田间与温室播种出苗率分别达到了91.9%、87.9%和78.3%，与常规层积均无显著差异，能够满足生产需求。但我国苹果产区幅员辽阔，生产上还有很多砧木种子应用，如八棱海棠（Malus robusta）、楸子（Malus prunifolia）和新疆野苹果（Malus sieversii）等乔化砧木，还有无融合矮化或半矮化砧木中砧一号、青砧一号和辽砧106[23-25]等，这些砧木采用冻干处理打破休眠的可行性还需试验验证。