新疆梨种质资源的火疫病抗性评价*

陈励坤，徐叶挺，王永鹏，何临梓，曾 斌，艾沙江·买买提

（1 新疆农业大学园艺学院，乌鲁木齐830000）（2 新疆农业科学院园艺作物研究所）

梨火疫病是由淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）引起的细菌性病害，对蔷薇科果树具有毁灭性的危害[1]，梨火疫病菌侵入寄主后对其造成永久性的结构破坏，最终致其死亡。该病传播能力极强，美国、荷兰、德国等世界多地的林果产业都曾受其严重危害[2-3]。2016 年梨火疫病入侵我国新疆地区[4]，破坏原有生态，严重阻碍了林果产业的发展，抗病种质资源筛选培育的问题亟待解决。

药物施用与果树修剪可作为紧急方案短期内应对梨火疫病的侵害[5-6]，抗病品种筛选培育是当前最有效的长期防治手段。前人对梨和苹果抗火疫病品种鉴定已进行大量研究，先后从野生资源中鉴定出了Solanka、Prairie Gem、Chancleer 等表现为高抗的梨品种[7-9]，野生资源与驯化品种多代杂交培育出了高抗的CG 系列苹果砧木[10]。Paprstein 等[11]对试管幼苗采用剪切接菌法，发现感病品种幼苗会产生病斑，渗出白色菌脓。Piotr 等[12]采用叶片浸泡法，成功鉴定出了Malus J-2003-05、Malus Early Szampion 2 个高抗品种。李洪涛等[13]采用枝条针刺接菌的方法，比较了不同菌株致病力的差异。前人研究表明，花朵、幼苗喷施接菌法同样可用于抗性鉴定[14]。

新疆梨是我国5 个主栽梨系统之一[15]，由西洋梨与东方梨杂交而来[16]。抗火疫病基因的遗传和积累对后代的抗性水平有显著影响[17]。本研究通过对31 个新疆梨品种的嫩叶、嫩枝接种梨火疫病菌，置于适宜环境中离体培养，对其感病性观察记录，分析品种间的抗性差异，初步探讨供试品种对火疫病的抗性及新疆梨系统整体抗性水平，为后续抗病梨种质资源的选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验接种所用的梨火疫病菌（E.amylovora）由南京农业大学胡白石教授惠赠，菌株分离于新疆库尔勒沙依东园艺场，寄主为库尔勒香梨。供试的31 个梨品种均属于新疆梨系统（表1），供试材料来源于新疆农业科学院轮台果树资源圃，选择树体健康、长势良好的梨树采集所需嫩叶、嫩枝。

表1 供试新疆梨品种

新疆梨接种火疫病菌的发病情况Incidence of Pyrus sinkiangensis Yu inoculated with Erwinia amylovora

1.2 试验处理与方法

1.2.1 火疫病菌的培养

采用平板划线法将病菌接种至NA 培养基，密封之后置于恒温培养箱中，28 ℃培养24 h 后，挑取单菌落接种于NB 培养基，置于28 ℃恒温摇床中150 r/min 培扩繁24 h，肉眼观察为纯白色，OD600＝0.4 为标准接种菌液。

1.2.2 嫩叶接菌

采集完全展开的幼嫩健康叶片，置于保鲜箱中备用；纯水清洗叶片后，用紫外线杀菌20 min，将多余叶柄剪去保留0.5 cm 左右，在超净工作台中用微量注射器吸取2 μL 菌液从叶片背面刺入主叶脉；将湿润的无菌滤纸置于无菌培养皿中，用无菌牙签搭三角架，叶片背面朝上置于牙签三角架上，防止叶片沾水褐化，置于28 ℃恒温箱中培养，每个品种接种3 片叶，每隔24 h 观察1 次叶片发病情况，并记录各时间段叶片主叶脉的病变长度，共观察记录96 h。

对供试31 个梨品种叶片各时间段主叶脉平均病变长度进行聚类分析，评价其抗性。

1.2.3 嫩枝接菌

选取健康的当年生嫩枝，采集后枝条下端用湿润纱布包裹备用；纯水清洗枝条后，用紫外线杀菌20 min；在完全展开的第2 片叶基部的主茎上，用微量注射器斜向下刺孔，将2 μL 菌液滴入嫩梢中；将枝条置于室内培养，下端放入水中培养，每个品种接种3 根枝条，每隔24 h 观察记录枝条的病变长度，共观察记录96 h。

根据李洪涛等[13]制定的火疫病接种离体枝条病情分级，将枝条病变长度与枝条总长之比作为病级代表值：0 级，枝条无病变现象；1 级，病变长度占接种枝条长度的1%～5%；3 级，病变长度占接种枝条长度的6%～15%；5 级，病变长度占接种枝条长度的16%～30%；7 级，病变长度占接种枝条长度的31%～50%；9 级，病变长度占接种枝条长度的50%以上。

病情指数＝［∑（各级发病枝条数×各级代表值）/（调查总枝条数×最高级代表值）］×100

根据相同时间内的病情指数，将供试品种离体枝条抗病能力分为4 个等级，高抗（HR）：病情指数为1～15；中抗（MR）：病情指数为16～35；中感（MS）：病情指数为36～69；高感（HS）：病情指数≥70。

1.2.4 幼果接菌

采集幼果后保存于10 ℃左右的环境中，尽量保证果皮蜡质层不被破坏；将果实整体浸入75%酒精溶液中2 min 左右，进行表面消毒，用无菌滤纸吸干表面残留的酒精后，将果实纵剖为两半，在果实每一个剖面靠近果核周围选择6 个接菌点，用微量注射器每个接菌点注入2 μL 菌液。接菌后将果实放在铺有湿润无菌纱布的瓷盘中，并用保鲜膜覆盖，置于28 ℃左右恒温箱中培养，每隔24 h 观察1 次果实剖面变化，共观察记录96 h。

1.3 数据统计分析

用Excel 2010 整理试验数据，用SPSS 26 软件进行差异显著性分析检验及聚类分析，数据均用平均值±标准误差表示。

2 结果与分析

2.1 叶片病变分析

2.1.1 叶片发病进程

由图版2-A 可以看出，梨叶片被火疫病菌侵染后，主叶脉发生病变褐化，病变长度随时间逐渐增加。从表2 可以看出，供试的31 个梨品种接菌后24、48、72、96 h 主叶脉平均病变长度分别为0.57、1.24、2.12、2.92 cm，相邻2 个时间点病变长度差分别为0.57、0.67、0.88、0.80 cm。经方差分析，4个时间段的主叶脉平均病变长度差异显著。从整体可以看出，梨叶片接种梨火疫病菌后48～72 h 主叶脉病变最快。

表2 供试梨品种嫩叶对火疫病抗性测定结果

续表2

供试梨品种叶片接菌24 h 后，主叶脉平均病变长度为0.57 cm，其中棉梨最短（0.24 cm），沙03最长（0.91 cm），二者差异显著；接菌后48 h，主叶脉平均病变长度为1.24 cm，其中棉梨最短（0.80 cm），沙02 最长（2.04 cm），二者差异显著；接菌后72 h，主叶脉平均病变长度为2.12 cm，其中绿梨最短（1.33 cm），沙02 最长（3.57 cm），二者差异显著；接菌后96 h，主叶脉平均病变长度为2.92 cm，其中绿梨最短（1.82 cm），库尔勒香梨最长（4.65 cm），二者差异显著（表2）。

最终结果表明，叶片接菌96 h 后发病最轻的是绿梨，发病最严重的是库尔勒香梨。绿梨在接菌后24、48、72、96 h 主叶脉病变长度分别为0.36、0.86、1.33、1.82 cm，相邻2 个时间点主叶脉病变长度差分别为0.36、0.50、0.47、0.49 cm，可见接菌后0～24 h 病变最慢，24～48 h 病变最快，各时间段病变速度平稳相近。库尔勒香梨在接菌后24、48、72、96 h 主叶脉病变长度分别为0.71、1.55、3.52、4.65 cm，相邻2 个时间点主叶脉病变长度差分别为0.71、0.84、1.97、1.13 cm，接菌后0～24 h 病变最慢，48～72 h 病变最快，各时间点病变增速差异明显。接菌后4 个时间点库尔勒香梨主叶脉病变长度分别是绿梨的1.97、1.80、2.65、2.55 倍（表2）。

2.1.2 叶片抗病等级分析

对供试31 个梨品种各时间点主叶脉病变长度进行欧氏距离聚平均法连锁聚类分析，如图1 所示，当连锁距离为3 时，被分为4 个类群。也历克阿木特、棉梨、霍城冬黄梨等16 个品种聚为A 类，主叶脉综合平均病变长度为1.31 cm，为高抗品种；酸秤砣、库尔勒黄酸梨、绿梨等7 个品种聚为B 类，主叶脉综合平均病变长度为1.72 cm，为中抗品种；伊犁红句句梨、黑酸梨和沙01 聚为D 类，主叶脉综合平均病变长度为2.26 cm，为中感品种；库尔勒香梨、奎克阿木特、株选1 号等5 个品种聚为C 类，主叶脉综合平均病变长度为2.68 cm，为高感品种（图1）。

图1 供试梨品种叶片发病情况聚类分析树状图

2.2 枝条病变分析

2.2.1 嫩枝发病进程

梨嫩枝被火疫病菌侵染后发生病变，表现为由接菌点逐步向下褐化变黑（图版2-B）。如表3 所示，供试梨品种接菌后24、48、72、96 h 嫩枝平均病变长度分别为1.12、2.73、4.88、8.75 cm，相邻2个时间点嫩枝病变长度差分别为1.12、1.61、2.15、3.87 cm。经方差分析，4 个时间点之间嫩枝平均病变长度差异显著。从整体可看出，嫩枝接菌后72～ 96 h 病变最快。

表3 供试梨品种嫩枝对火疫病抗性测定结果

如表3 所示，接种火疫病菌后供试31 个梨品种的嫩枝在各时间点的发病程度差异明显。接菌后24 h，嫩枝平均病变长度为1.12 cm，其中绿梨嫩枝无病变，沙01 最长（2.39 cm）；接菌后48 h，嫩枝平均病变长度为2.73 cm，其中绿梨最短（0.40 cm），株选1 号最长（5.26 cm），二者差异显著；接菌后72 h，嫩枝平均病变长度为4.88 cm，其中绿梨最短（0.63 cm），褐色句句梨最长（12.23 cm），二者差异显著；接菌后96 h，嫩枝平均病变长度为8.75 cm，其中绿梨最短（1.03 cm），褐色句句梨最长（22.49 cm），二者差异显著。

由表3 可以看出，嫩枝接菌96 h 后发病最轻的是绿梨，最严重的是褐色句句梨。绿梨在接菌后24、48、72、96 h 嫩枝病变长度分别为0、0.40、0.63、1.03 cm，相邻2 个时间点嫩枝病变长度差分别为0、0.40、0.23、0.40 cm，可见接菌后0～24 h 病变最慢，24～48 h 与72～96 h 2 个时间段病变最快，整体病变幅度较小，趋势平缓。褐色句句梨在接菌后24、48、72、96 h 病变长度分别为1.58、4.82、12.23、22.49 cm，相邻2 个时间点嫩枝病变长度差分别为1.58、3.24、7.41、10.26 cm，可见接菌后0～24 h病变最慢，72～96 h 病变最快，各时间点嫩枝病变增长速度有较大差别。接菌后在48、72、96 h 褐色句句梨的嫩枝病变长度分别是绿梨的12.05、19.41、21.83 倍。

2.2.2 枝条抗病等级分析

对接菌后24、48、72、96 h 嫩枝发病情况进行统计分析，各品种的综合病情指数及抗性等级如表4 所示，综合病情指数最低的是绿梨，为30.56，最高的是句句梨，达72.22。棉梨、也历克阿木特和绿梨3 个梨品种表现为中抗，句句梨表现为高感，其他27 个梨品种均表现为中感。

表4 供试梨品种病情指数和抗性等级

2.3 果实病变

梨幼果剖面接菌后，抗病品种幼果剖面始终无明显变化，只存在少量白色小菌脓；感病品种接菌后24 h 之内，接菌点开始渗出白色菌脓，后形成大片菌脓并逐渐变黄发褐，果实也随之出现皱缩甚至开裂的现象。如图版2-C 所示，棉梨、也历克阿木特和句句梨3 个梨品种幼果接菌后72 h 的剖面表现，可明显看出抗病品种棉梨和也历克阿木特果实剖面只有极少量白色菌脓；感病品种句句梨果实剖面被大片菌脓覆盖，同时幼果逐渐褐化、皱缩。

3 讨论与结论

抗病资源的鉴定是抗病育种的基础[18]，室内接菌是最为常用的品种抗病水平鉴定手段。前人所用的接菌方法及指标也各有不同，花朵喷施菌液、剪切接菌、浸泡接菌、果柄注射接菌等[11,19]，花朵被病菌侵染后其发病程度难以量化，难适用于多品种抗性水平的鉴定中。抗性检测中菌液的量可能会影响发病进程，前人研究中少有对菌液定量的案例，本试验中采用微量注射器定量注射菌液，以“接菌口有菌液珠但不溢出”为准，经多次预试验确定嫩叶、嫩枝、幼果的接菌量，进一步准确鉴定品种的抗病水平。

本研究结果表明，棉梨和也历克阿木特在叶片鉴定中表现为高抗，在枝条鉴定中表现为中抗，与其他品种相比抗性较强；绿梨抗性次之，其在叶片和枝条鉴定中均表现为中抗。据前人研究植株受胁迫后体内SOD、POD、CAT 活性和MDA 含量会提高[20-23]，后续研究可测定接菌后棉梨、也历克阿木特和绿梨植株内上述物质含量，进一步验证抗病水平。供试的31 个新疆梨品种对于梨火疫病抗性表现具有显著性差异，整体抗病水平偏低。前人研究表明，火疫病抗性受基因控制[24]，抗病性由双亲遗传给下一代，新疆梨系统是由西洋梨和东方梨杂交而来，西洋梨对火疫病表现为易感[25]，新疆梨可能受西洋梨的遗传影响，整体上表现为感病。

本研究中，棉梨、也历克阿木特和绿梨对梨火疫病的抗性综合表现较好，其中绿梨的单花药花粉量多、花粉活力强且萌发率高[26]，果实硬度小，种子多，是优良的育种材料。将高抗基因遗传积累是杂交育种培育抗病材料的整体思路[27]。Evrenosoğlu等[28]研究表明，梨火疫病抗性为多基因遗传，母本遗传效应高于父本，但植株抗火疫病的表型在很大程度上受到环境变化的影响，因此在后续杂交培育抗病材料的方案中需因地制宜。综上，棉梨、也历克阿木特和绿梨可作为后续抗梨火疫病育种研究的材料。