橄榄苦苷改善db/db小鼠糖尿病的肝脏转录组学及生物信息学分析

郑淑娟，谢子鑫，方靖靖，王亚楠，耿睿璇，赵雨菡，李梦杰，仝 涛,2,*，黄昆仑,2,*

（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，精准营养与食品质量重点实验室，教育部功能乳品重点实验室，北京 100083；2.农业农村部转基因生物安全评价重点实验室（食品安全），食品质量与安全北京实验室，北京 100083）

糖尿病是一种慢性代谢性疾病，其特征是高血糖，主要发病原因为胰岛素抵抗、胰岛素产生不足或两者兼而有之。2019年国际糖尿病联盟报告全球糖尿病患者4.63亿，占全球人口的9.3%；随着发病率的上升，预计到2030年，全球将有5.78亿糖尿病患者。患有2型糖尿病的糖尿病患者约占所有糖尿病患者的90%。随着被诊断出患有2型糖尿病的人数增加，患者需要更有效的药物缓解2型糖尿病。

橄榄苦苷（oleuropein，OP）是一种棕黄色水溶性粉末，于1959年被分离出来，由羟基酪醇、橄榄酸和葡萄糖苷组成（图1），主要存在于橄榄叶、未成熟的橄榄果和初榨橄榄油中。据报道OP具有多种生物学功能，如减肥、缓解糖尿病、改善非酒精性脂肪肝、改善糖尿病肾病、改善糖尿病心肌病和预防脱发等。

图1 OP的结构Fig. 1 Structure of oleuropein

在2型糖尿病的自然病程中，胰岛β细胞功能随着病程的延长而逐渐下降。随着糖尿病的进展，β细胞功能会逐渐恶化，胰岛素生物合成和分泌会逐渐减弱，而且β细胞增殖也显著减少，导致β细胞量减少。在表现出显著高血糖的肥胖2型糖尿病模型/小鼠中，在糖尿病初期胰岛会发生代偿性肥大，但这种代偿能力随着时间延长逐渐减弱。此外，长期的糖尿病会导致糖尿病神经病变、糖尿病视网膜病变、糖尿病心血管并发症、糖尿病肾病等多种并发症出现。与糖尿病初期相比，病程延长的糖尿病小鼠胰岛中葡萄糖转运子2和胰高血糖素样肽-1受体的表达下调。

前期研究发现OP可以改善患有较长病程的/小鼠的2型糖尿病。使用年龄为17 周的/小鼠为研究对象，每日给予小鼠200 mg/kg的OP，共进行了15 周实验，结果显示OP具有降低空腹血糖、改善葡萄糖耐量、降低胰岛素抵抗指数、恢复胰脏胰岛组织学特点、上调/小鼠肝脏Akt蛋白（蛋白激酶B）磷酸化水平的作用。进一步发现OP影响了/小鼠肠道微生物的多样性和多样性，改变了肠道微生物的组成，如增加了嗜黏蛋白阿克曼氏菌（）等微生物的相对丰度以及降低假长双歧杆菌（）等微生物的相对丰度。OP的降血糖功效与其能改善肠道微生物群落特征有关。肝脏作为人体重要的代谢器官，对维持机体葡萄糖稳态起着重要的作用。在禁食期间肝脏能产生葡萄糖，在餐后肝脏能储存葡萄糖。因此，除了前期研究的肠道微生物外，OP还有可能通过作用于肝脏缓解/小鼠的高血糖症。本研究将从肝脏基因表达变化的角度探究OP改善/小鼠2型糖尿病的可能作用机制。

转录组测序可以识别经处理后mRNA表达水平发生的变化。近年来，转录组测序已被应用于研究发病机制和筛选生物标志物指标，在糖尿病、糖尿病并发症和神经退行性疾病等复杂疾病的诊断和预后中发挥了重要的作用。本实验研究OP对肝脏基因表达的影响，利用Ilumina NovaSeq 6000测序平台，对小鼠的肝脏进行转录组测序，以鉴定OP改善/小鼠2型糖尿病的差异表达基因和富集的信号通路并推测关键差异表达基因，为深入研究OP改善/小鼠2型糖尿病的可能作用机制提供更多依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

OP（分析纯） 成都普瑞法科技开发有限公司；TRIzol、SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit试剂盒 美国Invitrogen公司；DNase I 日本TaKaRa公司；TruSeqRNA Sample Preparation Kit试剂盒美国Illumina公司。

1.2 仪器与设备

2100生物分析仪 美国安捷伦公司；ND-2000微量分光光度计 美国Thermo公司；NovaSeq 6000测序仪美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 实验动物和方案设计

动物实验方案由中国农业大学实验动物福利和动物实验伦理委员会批准（批号：AW11099102-3-4）。8 周龄的BKS-em/Gpt（/）无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性小鼠和相应年龄的野生型BKS-DB（/）SPF级雄性小鼠购买于江苏集萃药康生物科技有限公司，并饲养于农业农村部农产品质量监督检验测试中心（北京）动物实验室（SYXK（Jing）2020-0052）。动物实验室照明周期为12 h（每日早6∶30亮灯），房间湿度范围为40%～70%，温度范围为（22±2）℃。使用普通维持饲料将动物饲喂至17 周龄。之后，将/小鼠分为两组：/组（=7）和/＋OP组（=8）。实验期间，动物仍以普通维持饲料喂养，每笼3～4 只，自由饮水。每天对/小鼠灌胃OP（200 mg/kg） 或溶剂（水），共进行为期15 周的实验。实验结束时解剖取肝脏，装入冻存管，液氮速冻，于－80 ℃保存。每组随机取3 只小鼠的肝脏样本用于转录组测序和基因表达分析。本研究使用的动物即Zheng Shujuan等研究中的动物。

1.3.2 RNA的提取和转录组测序

小鼠肝脏RNA的提取方法为TRIzol法。提取后使用DNase I去除基因组DNA。将得到的RNA进行质检，以保证使用质量合格的样品进行建库测序。使用2100生物分析仪和ND-2000微量分光光度计进行质检，样品合格的标准为OD/OD=1.8～2.2，OD/OD≥2.0，RNA完整值≥6.5，28S/18S≥1.0，总量＞2 μg。使用TruSeqRNA Sample Preparation Kit试剂盒建立RNA文库。采用带有Oligo(dT)的磁珠从1 μg总RNA中富集有poly-A尾的mRNA。利用碎片缓冲液将获得mRNA随机断裂成约200 bp大小的片段。使用SuperScript Double-Stranded cDNA Synthesis Kit试剂盒，以mRNA为模板反转录合成第1链cDNA，随后进行第2链合成，形成稳定的双链cDNA。利用End Repair Mix将双链cDNA的黏性末端补齐为平末端后，在3’末端加上1 个A碱基，用于连接Y字形的接头。利用聚合酶链式反应对cDNA进行富集后，使用DNA Clean Beads筛选长度为200～300 bp的片段。经TBS380（Picogreen）定量后，使用Illumina NovaSeq 6000测序平台对构建好的文库进行高通量测序，测序读长为PE150。以上过程由上海美吉生物医药科技有限公司完成测序。

1.3.3 转录组数据分析

将测序得到的原始数据（raw data）经过去接头、低质量数据过滤筛选等流程后，得到高质量数据（clean data）。对mapped reads进行拼接，并与参考基因组注释信息进行比对。本研究采用每百万reads中来自于某转录本的读段数（transcripts per million reads，TPM）方法计算基因的表达量。再利用DEseq2软件包筛选差异表达基因，筛选阀值为|logfold change|≥1和＜0.05。使用Goatools （https://github.com/tanghaibao/Goatools）对差异基因进行基因本体论（Gene Ontology，GO）功能注释。使用KOBAS（http://kobas.cbi.pku.edu.cn/home.do）对差异表达基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.4 数据统计

所有数据均使用GraphPad Prism 8进行分析和绘图。使用非配对双尾检验进行比较，＜0.05，差异显著。

2 结果与分析

2.1 转录组测序数据及比对分析

前期的研究结果表明，OP能显著降低/小鼠的空腹血糖（339.5 mg/dL vs 512.5 mg/dL）。OP组/小鼠的空腹血清胰岛素水平（19 058.4 nIU/mL ）与对照组/小鼠的空腹血清胰岛素水平（20 824.7 nIU/mL）相比尽管未达到统计学差异，但有降低的趋势。OP不改变/小鼠血清中甘油三脂、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇的水平。OP能够改善/小鼠的葡萄糖耐受，降低胰岛素抵抗指数。基于OP对/小鼠2型糖尿病的良好改善效果，为了更加深入研究OP对肝糖代谢功能的影响，利用转录组测序对/组、/组和/＋OP组小鼠的肝脏进行了分析。将转录组测序结果与参考基因组进行比对共得到530 092 506 个原始reads，经质控后共得到525 442 400 个clean reads。在获得的clean reads中，所有样品的唯一比对率均达到82%以上（表1）。值均大于97%，值均大于93%。这表明测序的数量和质量达到了后续分析的要求。

表1 样本测序质量和序列比对Table 1 Sample sequencing quality and sequence mapping

2.2 差异表达基因分析

图2展示了3 组之间的差异表达基因（＜0.05和|logFC|≥1）。野生型/组小鼠和/组小鼠之间有1 420 个基因在表达上有显著差异。其中，与/组相比，/组中有734 个基因显著上调，686 个基因显著下调。/组小鼠和/＋OP组小鼠之间有539 个基因在表达上有显著差异。其中，与/组相比，/＋OP组中有450 个基因显著上调，89 个基因显著下调。

图2 差异表达基因分析Fig. 2 Differentially expressed genes

2.3 OP对肝脏基因生物学过程的影响

进一步对OP处理组的上调和下调差异表达基因进行GO注释分析，并对排名前20的生物学过程进行分析及汇总。OP处理组上调差异表达基因注释到的前20的生物学过程中，分子功能分组主要涉及分子功能调节剂、催化活性和结合；细胞组分分组主要涉及细胞外区域部分、膜、细胞部分、含蛋白质复合物、细胞器部分、细胞器和膜部分；生物过程分组主要涉及代谢过程、细胞成分组织或生物发生、免疫系统过程、细胞过程、发育过程、定位、对刺激的反应、多生物过程和多细胞生物过程（图3a）。

OP处理组下调差异表达基因注释到的前20的生物学过程中，分子功能分组主要涉及分子功能调节剂、催化活性、结合；细胞组分分组主要涉及细胞外区域部分、细胞外区域、膜、细胞部分、含蛋白质复合物、细胞器部分、细胞器、膜部分；生物过程主要涉及代谢过程、细胞成分组织或生物发生、细胞过程、发育过程、定位、对刺激的反应、多生物过程、生物调节和多细胞生物过程（图3b）。

图3 OP处理后的差异表达基因的GO注释分析Fig. 3 GO annotation analysis of differentially expressed genes after oleuropein treatment

2.4 KEGG分析

KEGG是通过分子水平信息了解生物系统（如细胞、组织和生态系统）高级功能和作用的数据库资源。KEGG富集图中显示了OP上调和下调的差异表达基因富集程度分别排在前20的通路，其中上调的差异表达基因主要富集在磷酸肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-Akt信号通路，下调的差异表达基因主要富集在真核生物中核糖体的生物发生和花生四烯酸代谢途径（图4）。结合研究目的，以及考虑到PI3K-Akt信号通路在糖尿病血糖调节中发挥的重要作用，在接下来的研究中选择PI3K-Akt信号通路进一步探究OP改善/小鼠2型糖尿病的机制。

图4 OP处理后上调和下调的差异表达基因的KEGG信号通路富集分析Fig. 4 KEGG signaling pathway enrichment analysis of differentially expressed genes after oleuropein treatment

2.5 PI3K-Akt信号通路相关差异表达基因分析

与/组相比，OP处理后上调的差异表达基因富集在PI3K-Akt信号通路上的有、、、、、、、、、、、和等（表2）。这表明OP缓解/小鼠2型糖尿病的效果可能与调节这些基因的表达有关。

除了这些关键的差异基因表达外，又对PI3K-Akt信号通路的整个代谢途径中差异基因可能参与的蛋白翻译进行了分析。在图5中，PI3K-Akt信号通路上黄色底色框代表完成整个PI3K-Akt信号通路所参与的蛋白。差异表达基因被映射到KEGG途径上，红色边框的节点代表差异基因显著上调的相关蛋白表达。一个节点上蛋白的翻译可能涉及多个差异表达基因。PI3K-Akt途径是一种细胞内信号转导途径，响应细胞外信号，促进代谢、增殖、细胞存活、生长和血管生成。这一过程是通过一系列下游底物的丝氨酸或苏氨酸磷酸化介导，涉及的关键蛋白是PI3K和Akt。从图5可以看出，在所富集到的PI3K-Akt信号通路中，OP处理后PI3K的上游蛋白受体酪氨酸激酶（receptor tyrosine kinase，RTK）、Toll样受体2/4（toll-like receptor 2/4，TLR2/4）、B细胞受体（B cell receptor，BCR）、细胞因子R、整合素（integrin alpha，ITGA）和细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的mRNA的表达水平都显著上调。这些蛋白分子都对PI3K有正向调节作用。OP处理后，热休克蛋白（heat shock protein 90，HSP90）和蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）mRNA的表达水平都显著上调。HSP90对Akt的活性有正向调节作用，PP2A对Akt活性有负向调节作用。而前期初步研究结果已经显示OP能够增加/小鼠肝脏中Akt磷酸化水平。这表明HSP90的作用可能强于PP2A的作用。

表2 OP处理后富集在PI3K-Akt信号通路上调的差异表达基因Table 2 Up-regulated differentially expressed genes enriched in PI3K-Akt signaling pathway after oleuropein treatment

图5 PI3K-Akt信号通路图Fig. 5 PI3K-Akt signaling pathway

3 讨论与结论

肝脏对于维持正常的葡萄糖稳态至关重要——它在禁食期间产生葡萄糖并在餐后储存葡萄糖。然而在2型糖尿病中，发生在肝脏中的这些过程失调，这种不平衡导致空腹和餐后高血糖。2型糖尿病患者亚临床肝脏胰岛素抵抗会导致明显的空腹高血糖。在患有2型糖尿病的个体中，在基础生理条件下肝脏葡萄糖产生的比率会增加，并且在胰岛素的生理水平和适度的超生理水平下，胰岛素依赖性肝脏葡萄糖产生会受到损害。

胰岛素信号传导由胰岛素与靶细胞膜上的胰岛素受体结合触发。胰岛素与胰岛素受体的亚基结合后会激活胰岛素受体的亚基的酪氨酸激酶，引起亚基酪氨酸残基磷酸化。活化的胰岛素受体能招募并激活胰岛素受体底物。活化的胰岛素受体底物能激活下游信号通路，从而实现胰岛素的生物学功能，其中PI3K-Akt途径是胰岛素发挥生物学功能重要途径之一。胰岛素抵抗涉及的关键分子包括PI3K和Akt。Akt是PI3K的靶蛋白，能够促进肝糖原生成、抑制肝糖异生。肝脏特异性敲除Akt的小鼠会表现出葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗的情况。已有研究发现高脂饮食的雌性小鼠在饮用溶解于饮用水中的OP（3%）8 周后，肝脏中Akt磷酸化增加，肝脏脂肪变性得到了改善。先前的结果表明OP增加了/小鼠肝脏中蛋白Akt的磷酸化。转录组测序分析结果显示OP上调的差异表达基因经KEGG富集后主要集中在PI3KAkt信号通路。本研究根据logFC≥2的标准，筛选出所富集的PI3K-Akt通路中关键差异表达基因为、、、、、、、、、和。

花生四烯酸的酶促反应途径主要涉及细胞色素P450酶4A代谢途径、脂氧合酶5代谢途径、环氧合酶2代谢途径。研究表明，抑制细胞色素P450酶4A、脂氧合酶5或环氧合酶2能改善胰岛素抵抗。例如，敲底/小鼠的细胞色素P450酶4A表达水平改善了/小鼠葡萄糖不耐受的情况；高脂膳食导致大鼠产生胰岛素抵抗，选择性抑制环氧合酶2可改善高脂膳食引起的胰岛素抵抗；敲除脂氧合酶5可显著改善小鼠的胰岛素抵抗。肝脏转录组生物信息学分析结果显示，相比于/组小鼠，OP处理组肝脏中花生四烯酸代谢途径显著下调。这表明OP可能通过下调花生四烯酸代谢改善/小鼠2型糖尿病。

OP可显著改善/小鼠的肝脏基因表达谱，与未经治疗的/鼠相比，OP处理组共有539 个差异表达基因，其中包括450 个显著上调基因，89 个显著下调基因。通过对OP处理产生的差异表达基因进行KEGG通路富集，发现差异表达基因发生了以PI3K-Akt信号通路激活为特征的功能转变。OP引起了PI3K-Akt信号通路中、等27 个差异表达基因的显著上调，其中、、、、、、、、、和可能是关键的差异表达基因。未来仍需要深入研究验证转录组学的推测，以及更多的证据揭示OP通过PI3K-Akt信号通路缓解2型糖尿病的分子机制。