云南鸡血藤水提物和醇提物的体外抗菌活性研究6

王播勇，马运敏，李汉伟，刘久东，普元倩，自加吉，杨 飞，熊 伟

（1. 云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室，云南，大理 671000；2. 大理大学基础医学院，云南，大理 671000；3. 大理白族自治州第一人民医院，云南，大理 671000；4. 江苏省仪征市林业生产指导站中心，江苏，仪征 211400；5. 云南农业大学高原特色农业产业研究院，云南，昆明 650100）

鸡血藤，又名大血藤、血藤、血风藤、三叶鸡血藤等，为《中国药典》收载的常用中药材，来源于豆科植物密花豆Spɑtholobus suberectusDunn 的干燥藤茎[1]。鸡血藤入药时间较晩，直至清代方见记载。始载于清代赵学敏《本草纲目拾遗》，谓之：一茎长数十里，土人得之，以刀砍断，则汁出如血。鸡血藤以有3 ～8 个红褐色偏心形半圆环、渗出树脂物多者和半环纹多者为佳[2]。其味甘、苦，性温，归肝、肾经，具有活血补血、舒筋活络、调经止痛的功效，常用于治疗血虚萎黄、月经不调、痛经、经闭等症[3]，主要分布于我国云南、广西、广东和福建等地。于每年秋冬两季采收，因采收时藤条流出的汁液鲜红如鸡血，故名鸡血藤[4]。据统计，以鸡血藤为原料生产的中成药如鸡血藤颗粒、花红片等达50 余种，以鸡血藤为原料组成的中药复方制剂获得的专利多达150 余项[5]。现市场上的鸡血藤药材多来源于野生采摘。随着近些年用药需求量的增大，加之利益链的驱使，野生资源也快濒临枯竭。现我国广西、广东省份的野生资源已濒临枯竭，仅云南省尚有一定野生资源，但蕴藏量已很低[6]。

我们研究组根据《中国植物志》官方网站（http://www.iplant.cn/）2020 年下半年开始接受原崖豆藤属（Millettiɑ）部分物种修订为鸡血藤属（Cɑlleryɑ Endl），正式将鸡血藤属与崖豆藤属分为两属[7]。现代研究表明，鸡血藤含有黄酮类、三萜类、苯丙素、苷类、酚类、甾醇类、蒽醌类等成分，具有改善造血系统功能、抗肿瘤、抗炎、抗氧化等作用，具有广阔的开发前景[8-9]。近年来，由于抗生素的使用不合理及超剂量，导致临床耐药菌株迅速增加，抗生素的抗菌活性下降，不仅增加了养殖成本，而且导致动物产品中抗生素残留，给人类的健康带来严重的威胁。目前，减少耐药菌株的出现和研究合成新的抗菌药物已成为一个世界性难题，而中草药以无毒副作用、无残留及细菌不易产生耐药性等优势成为人们关注的热点[10]。研究表明，鸡血藤对临床常见的金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌等多种致病微生物均有不同程度的抑制作用，但对鸡血藤发挥抗菌作用的药效成分及作用机制尚缺乏整体认识[11]。云南鸡血藤是一种具有潜在抗菌活性的资源植物，本研究采用灭菌的去离子水和75%乙醇对云南鸡血藤中有效成分进行了提取，并对不同提取物的体外抗菌活性进行了试验，现将研究结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 供试样品

正品云南鸡血藤于2021 年8月购自云南省大理白族自治州大理市一心堂大药房。经大理大学药学院生药学教研室张德全教授和张海珠教授鉴定为豆科植物密花豆（Spɑtholobus suberectusDunn）的干燥藤茎。

1.2 试剂与仪器

TSA、TSB、改良马丁培养基（Oxioid 公司），胎牛血清、LB 液体、固体培养基（环凯生物有限公司），75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇和二甲基亚砜（DMSO）均为分析纯试剂（国药集团化学试剂有限公司）。实验用水为灭菌的去离子水。ED204型电子天平（梅特勒－托利多仪器上海有限公司），SB25-12DTDN 超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司），RE-225AA 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），SHB-III 型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），SW-CJ-2FD 超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），LDZX240B I立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海博讯实业有限公司医疗设备厂），HZQ-F160 型全温振荡培养箱（上海朗赋实业有限公司），FW100 型高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司），多功能酶标仪（赛默飞世尔科技中国有限公司），微量移液器（德国Eppendorf 公司）。

1.3 供试菌种及培养条件

实验所用表皮葡萄球菌（Stɑphylococcus epidermidis）、金黄色葡萄球菌（Stɑphylococcus ɑureus）、枯草芽孢杆菌（Bɑcillus subtilis）、大肠杆菌（Escherichiɑ coli）、绿脓杆菌（Pseudomonɑs ɑeruginosɑ）、变形杆菌（Proteus vulgɑris）、 白假丝酵母菌（Cɑndidɑ ɑlbicɑns）和黑曲霉（Aspergillus roger）均由大理大学基础医学院病原生物学综合实验室提供。金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌，大肠杆菌、绿脓杆菌和变形杆菌为革兰氏阴性菌，白假丝酵母菌和黑曲霉为真菌。除黑曲霉需用改良马丁培养基于28℃培养5 d外，其余各菌种均于营养琼脂培养基37℃培养24 h[12]。

1.4 方法

1.4.1 鸡血藤提取物的制备

取干燥的云南鸡血藤20 g，粉碎，过40 目筛，分别用灭菌去离子水及不同浓度的乙醇进行索氏提取，溶液在80℃水浴上回流提取，固液比为1:10，回流3 h。将提取物浓缩，低温真空干燥至粉末，得到鸡血藤水提物和不同浓度乙醇的鸡血藤提取物，测定其冻干物的质量，4℃冰箱密封保存备用。待抗菌活性体外实验时用10%DMSO 溶液使其溶解并用灭菌蒸馏水稀释至一定体积。

1.4.2 菌悬液的制备

将上述供试菌种用适宜的斜面活化后，用灭菌的去离子水制成含菌数约为1×105CFU/mL 菌悬液，待用。

1.4.3 体外抗菌活性试验

1.4.3.1 云南鸡血藤水提取物及乙醇提取物抑菌直径的测定

抑菌直径的测定采用琼脂扩散法[13-14]。用无菌棉签蘸取1×105CFU/mL 的试验菌悬液，在营养琼脂平板表面均匀涂抹3 次，然后绕平板边缘涂抹一周，盖好平皿，室温干燥5 min，滤纸片(直径6.0 mm)平放于无菌平皿内，每片滴加不同浓度乙醇提取液及水提取物20 μL，室温自然晾干，用无菌镊子取样片轻轻贴放于平板表面，每个平板贴3 片实验样片，1 片10%DMSO 为对照片。各实验菌株在相应的培养条件下培养，测量抑菌直径。每个实验重复3 次。

1.4.3.2 云南鸡血藤水提取物及乙醇提取物MIC及MBC 的测定

我们实验中最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC) 及最小杀菌浓度(minimal bactericidal concentration, MBC)的测定采用微量肉汤稀释法[15-16]。MIC 即药物与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。MBC 即在MIC 基础上，从每管吸取10 μL 溶液，点于固体培养基上，继续按MIC 培养条件下培养，以杀灭99.9%细菌数量的最低浓度为最小杀菌浓度。采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水稀释系列浓度（0.064 ～65.8 mg/mL)，在96 孔板上每孔加100 μL不同浓度的药液和100 μL 菌液，使最终菌液浓度为1×105CFU/mL，以无菌生理盐水加菌液做为阳性对照。每个实验重复3 次。

1.4.4 云南鸡血藤提取物热稳定性的测定

将不同稀释度的云南鸡血藤提取物置于20、40、60、80、100℃水浴和121℃湿热条件下处理10 min 后，分别测定其抑菌活性。

1.4.5 云南鸡血藤提取物紫外光稳定性的测定

将不同稀释度的云南鸡血藤提取物在紫外灯下处理10、20、30、40、50、60 min 后，分别测定其抑菌活性。

1.4.6 统计学分析

采用IBM SPSS 26.0 软件对数据进行数据录入和统计分析。计量资料采用均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两个独立样本的t检验，检验水准定义为0.05。

2 结果

2.1 云南鸡血藤各提取物的得率

为选择一种较好的提取溶剂，本研究分别用55%、75%、95%乙醇和灭菌去离子水对云南鸡血藤进行提取来做抑菌效果的实验。20 g 鸡血藤生药经不同浓度的抑菌和水提取、浓缩、干燥和测定，得到的鸡血藤各提取物冻干物的质量和不同提取方法的得率（如表1）。结果表明，鸡血藤活性成分的提取率，乙醇高于水，同时发现75%的乙醇浓度的提取效果明显好于55% 和95%乙醇的提取液，因此本文以后均采用75%的乙醇来进行提取。

表1 云南鸡血藤提取物的质量及不同提取方法的得率Table 1 The quality of the extracts of Spɑtholobus suberectus Dunn and the yield of different extraction methods

2.2 云南鸡血藤水提物及75%乙醇提取物的抑菌直径

研究结果表明，云南鸡血藤75%乙醇提取物对同一种细菌的抑菌直径比水提物的抑菌直径更大。10%DMSO无抑菌活性。云南鸡血藤水提物和75%乙醇提取物对革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)比对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌和变形杆菌) 都更加敏感，对真菌(白假丝酵母菌和黑曲霉)则不敏感（图1）。由此可见，云南鸡血藤75%乙醇提取物比水提物的抑菌活性更强，抑菌活性差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 云南鸡血藤提取物的抑菌直径对比Fig.1 Comparison of inhibition zones of water extracts and ethanol extracts from Spɑtholobus suberectus Dunn

2.3 云南鸡血藤水提物及75%乙醇提取物的MIC 和MBC

研究结果表明，鸡血藤乙醇提取物对革兰氏阳性菌及阴性菌抗菌活性较强，而对真菌在65.8 mg/mL范围内没有抗菌作用，水提取物对革兰氏阳性菌的抗菌活性较强，而对革兰氏阴性菌及真菌在65.8 mg/mL范围内几乎没有抗菌作用。结果还显示，鸡血藤75%乙醇提取物比水提物的MIC及MBC小（结果如表2）。

表2 云南鸡血藤水提物及75%乙醇提取物的MIC 和MBC结果(mg/mL)Table 2 MICs and MBCs of water extracts and ethanol extracts from Spɑtholobus suberectus Dunn(mg/mL)

2.4 热处理对云南鸡血藤提取物抗菌效力的影响

提取物的热稳定性良好，经20、40、60、80、100、121℃处理15 min 后，75%乙醇提取物经121℃处理后抗金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌效力降低了1 倍，分别由2.06 mg/mL 变为4.12 mg/mL，由1.03 mg/mL 变为2.06 mg/mL，其余仍保持其原有的抗菌效力。而水提取物经121℃处理后抗表皮葡萄球菌的MIC 由4.12 mg/mL 变为8.24 mg/mL，其余都保持不变。由此可见，鸡血藤乙醇提取物及水提取物对100℃以下温度不敏感，经121℃高温处理，仅对个别菌种的抗菌活性产生微弱影响。

2.5 云南鸡血藤提取物紫外光稳定性的测定

将鸡血藤水提物和75%乙醇提取物分别在紫外灯下处理10、20、30、40、50、60 min 后测定其抑菌活性。结果表明，随紫外处理时间的变化，提取物的抑菌活性保持不变，由此可见，该提取物对紫外光具有极高的稳定性。

3 讨论

中草药是我国宝贵的天然资源，历经了几千年的使用和实践检验，其疗效确切，安全可靠。在治疗感染性疾病方面，因其成分复杂、作用靶点多、抗菌谱广，细菌较少对其产生耐药，能延缓甚至逆转细菌耐药性产生[17]。我们应当以此为契机，从中药材中寻找有效、低毒的抗菌药物，对解决细菌耐药性问题有非常大的潜力。鸡血藤基原自古以来较为复杂。根据考证，鸡血藤之名始见于《本草纲目拾遗》“鸡血藤”胶项下，结合《顺宁府志》、《顺宁杂著》、《顺宁药单》等记录及产地标本研究，认为云南凤庆鸡血藤膏基原为木兰科植物滇南五味子Kɑdsurɑ interior A.C.Smith、异 型 南 五 味 子Kɑdsurɑ heteroclite（Roxb.）Crɑib和 黄 龙 藤Schisɑndrɑ propinquɑ（Wɑll.）Bɑill.vɑr.intermediɑ AC.Smith，禄劝鸡血藤膏基原为豆科植物巴豆藤Crɑspedolobium schochii Hɑrms，这几种茎藤熬膏用，不做药材使用。而密花豆则是根据“剖断流汁，色赤若血”、“砍断则汁如血”的文献记载和野外调查，结合现代中药业老师傅的辨认经验，将其作为正品鸡血藤基原植物，并于1977 年版《中国药典》开始记载[18]。正品鸡血藤结实率低，种子未成熟果实已脱落，种子萌发率也不高，导致其自然繁殖率很低。虽然目前已经通过扦插繁育技术开展了鸡血藤人工种植，也颁布实施了一些地方标准和发明专利，如《鸡血藤规范化生产技术规程》等[19]，但因其生长周期比较长，鸡血藤大面积规模化人工种植还没有形成。

抗生素通常是细菌感染的主要治疗手段，很大程度上降低了世界范围内细菌感染的死亡率[20]。但在长期应用中产生了多种抗生素耐药性反应，从而导致其有效性降低[21]。此外，抗生素治疗可能导致毒性、过敏反应，甚至长期治疗后出现双重感染[22]，而天然产物是化学多样性的主要来源，能够提供各种有效的、不耐药的或弱耐药的抗菌药物[23]，从而为对抗细菌感染的研究提供了新的思路。鸡血藤化学成分复杂，临床应用广泛。现代药理研究表明，鸡血藤具有影响造血系统、抗血小板聚集、调节脂质代谢，抗心肌缺血及脑缺血、抗炎镇痛、抗肿瘤、抗氧化、调节酪氨酸酶等方面作用[3]。目前，国内外有少量关于鸡血藤提取物抗菌和抗病毒活性的研究报道。Park 等[24]的研究发现，鸡血藤中的黄酮类化合物7-羟基-6-甲氧基二氢黄酮和芒柄花素对变形链球菌和金黄色葡萄球菌的分选酶A（Srt A）有抑制作用，IC50值分别为46.1 μM 和41.8 μM，但不影响细胞活力。Cho 等[25]从鸡血藤中分离出20种黄酮类化合物，细胞聚集活性的抑制实验同样表明，7-羟基-6-甲氧基二氢黄酮和芒柄花素这两种化合物能够抑制SrtA，具有治疗金黄色葡萄球菌感染的潜力。鸡血藤水提物在犬肾细胞MDCK 中对流感病毒A1 具有抑制增殖作用，对流感病毒在鸡胚中的增殖也有抑制作用，每日灌注鸡血藤水提物还能降低病毒感染小鼠的死亡率、肺指数，改善肺病理切片坏死和浸润的症状[26]。鸡血藤醇提物具有抗甲型流感病毒、乙型肝炎病毒和单纯疱疹病毒I 型活性，且抗单纯疱疹病毒I 型效果显著[27-28]。此外，鸡血藤乙醇提取物还能抑制HCV 病毒的复制[29]。另有实验表明，鸡血藤水提液对萨奇病毒B3、B5、埃可病毒Echo 9、Echo 29、脊髓灰质炎病毒（Polio virus I,PVI）5 种肠道病毒属均呈现出不同程度的抑制或者杀伤作用，作用机制与抑制病毒生物合成及成熟释放，吸附在细胞表面或者进入细胞阻止病毒吸附进入相关[30]。

通过鸡血藤水提物和醇提物抗菌活性的对比研究，结果显示，鸡血藤两种提取物对3 种革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和枯草芽孢杆菌)均比对革兰氏阴性菌(大肠杆菌、绿脓杆菌和变形杆菌)及真菌(白假丝酵母菌和黑曲霉)的抗菌活性强，在65.8 mg/mL 的浓度范围内对真菌的MIC、MBC 未检出。在水提物和醇提物的抑菌活性体外研究中，鸡血藤乙醇提取物显示出良好的抗菌活性，尤其对革兰氏阳性菌更敏感，而75%乙醇提取物比相应的水提取物的抗菌活性更强。这说明鸡血藤的抑菌活性为一些极性较强的化合物，这与其它研究报道的鸡血藤抗菌活性的发挥的物质基础为黄酮类和多酚类相一致[21-22]。本研究发现，鸡血藤75%乙醇提取物比水提取物的抗菌活性强，这是因为鸡血藤中主要的活性物质为多酚类黄酮化合物，极性较强，需要用极性适合的溶剂来提取，抗菌活性高的活性成分更易溶于乙醇中。通过本研究可以得出，提取物对100℃以下温度不敏感，经12l℃高温处理，仅对个别菌种的抗菌活性产生微弱影响，随紫外光处理时间的变化，提取物的抑菌活性基本保持不变，由此可见，该提取物对热及紫外具有很高的稳定性。因此根据鸡血藤乙醇提取物的抗菌特性，可以选择75%乙醇的鸡血藤提取物作为临床感染性疾病的选择性用药，同时本研究也为鸡血藤资源的综合开发利用提供了科学依据。近年来，研究人员不断在鸡血藤分离中出新的化合物成分，但大部分药理研究仍停留在鸡血藤醇提物或水提物研究层面，药效物质基础及药理机制亟待深入研究[31]。同时，作为活血化瘀的经典药物，鸡血藤复方应用广泛，可结合中医药辨证论治，进一步研究复方药理作用以发掘鸡血藤更多的价值[32]。总之，本研究结果虽然显示鸡血藤水提物和醇提物对动物主要致病菌有不同程度的抑菌效果，但其在实验动物体内的抗菌活性尚需进一步研究。