水稻早衰突变体els-t的表型鉴定与基因克隆*

冯 巍, 周国强, 陈浩天, 马伯军, 陈析丰

(浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 321004)

衰老是细胞死亡和分解、组织和器官的退化、生命功能的老化等一系列退化过程，它受到细胞核和细胞质的严格控制.叶片衰老的起始不仅受到温度、光照、干旱、营养缺乏、损伤、病原体感染等外部环境的影响，还受到发育阶段、植物激素水平等内部遗传因素的影响[1-5].当叶片受到来自环境或内部本身的压力后，为了维持生命的进程，就会通过信号起始衰老基因的表达，进而使得叶片衰老死亡.叶片衰老涉及一系列的细胞学和生物化学变化，主要包括：细胞膜通透性的改变、核酸、蛋白质等生物大分子的降解、光合作用能力降低、叶绿体变性导致的叶绿素含量降低、丙二醛含量升高、活性氧、H2O2含量增加等[6-7].水稻作为单子叶植物，其营养的积累主要在于叶片中叶肉细胞的光合作用，但水稻叶片过早的衰老往往会减少光合作用时间、降低养分再转化效率和收获指数，进而影响水稻的品质和产量[8-10].相反，延迟叶片衰老对水稻生产力有潜在的积极影响，据理论推算,水稻叶片衰老每推迟1 d可增产2%，实践证明也可达到1%左右.因此，克隆叶片衰老的调控基因，解析其分子机制对提高水稻产量和品质具有重要意义.

目前，许多水稻叶片衰老相关基因已经被鉴定出来.这些基因可以根据代谢途径分为不同的类别：1)合成叶绿体并降解叶绿素的相关基因，包括NYC1，NOL，OsPAO，OsRCCR1，OsSGR，V1，V2等[11-14]；2)涉及GnT1，OsSAG12，Osh69，TDC1，TDC2 等蛋白的合成、降解和转运[15-19]；3)与激素信号通路有关，如OsFBK12，OsSAMS1，EIN2和EIN3等[20-22]参与了乙烯信号通路；4)与细胞程序性死亡(PCD)相关的基因，如RLS1，OsCATC，SPL28等[23-25].虽然，水稻叶片衰老相关的基因研究已经取得了较大的进展，但叶片衰老是一个非常复杂的过程，具体的分子机制尚不完全清楚，有待进一步研究.本研究从水稻诱变库中获得了一个早衰突变体els-t(earlyleafsenescence-temporary)，并对该突变体进行了表型鉴定、遗传分析与基因精细定位，通过PCR测序分析确定了候选基因，为进一步研究水稻早衰的分子机理提供参考.

1 材料与方法

1.1 试验材料

水稻早衰els-t突变体是籼稻品种镇恢084经60Co-γ辐射诱变而来，经多代自交，其突变表型遗传稳定.以els-t突变体为母本，分别与野生型对照镇恢084、日本晴杂交，获得F1代，F1代自交获得F2代群体.水稻材料均种植于浙江省金华市的大田中，4月中旬播种，10月份收获.

1.2 净光合速率测定

在水稻分蘖期的晴天上午，随机选取突变体els-t及其野生型对照镇恢084各3株，对其正常叶片采用LI-6800型便携式光合作用测定仪测定净光合速率，绘制光合曲线，每株重复测定3次，取其平均值作图.

1.3 叶绿素降解实验

在水稻分蘖期，选取els-t突变体及其野生型对照镇恢084的正常叶片，放置到装有20 mL纯净水的培养皿中，避光28 ℃分别处理0，3,5 d后，将叶片组织剪碎，按照Porra方法[26]测定叶绿素a和叶绿素b含量，每个材料重复测定3次，并进行t检验，分析突变体与野生型之间的显著性差异.

1.4 水稻农艺性状调查

根据刘建丰等[27]方法，在水稻抽穗时取els-t突变体与野生型对照镇恢084各15株，测定每株水稻的株高、分蘖数、剑叶长、剑叶宽；待水稻成熟后，取els-t突变体与野生型对照镇恢084各15株，考察穗长、结实率、粒长、粒宽、千粒质量.采用t检验进行显著性分析.使用GraphPad Prism 7软件绘制箱形图.

1.5 目的基因的连锁分析与精细定位

取水稻日本晴、els-t突变体及其杂交F2群体中15个野生型单株和15个早衰型单株，采用Murray 等[28]方法分别提取叶片的基因组DNA，并将所有的野生型F2单株或早衰型F2单株DNA等量混合，构建野生型DNA混池和早衰型DNA混池.采用覆盖水稻基因组的SSR和InDel标记[29-30]对日本晴与els-t突变体进行PCR扩增，PCR采用2×Taq PCR Master Mix试剂盒，程序为：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃复性30 s，35个循环；72 ℃ 延伸2 min；4 ℃保存.

用亲本间具多态性的SSR标记对野生型DNA混池和突变型DNA混池进行PCR扩增，在2个混池间筛选具多态性的标记，即目的基因连锁的标记，对目的基因进行初步定位.然后，用连锁分子标记对F2群体中的所有早衰型单株进行PCR扩增，并在定位区间内开发新的InDel标记(见表1)，对目的基因进行精细定位.

表1 InDel标记的PCR引物序列

1.6 候选基因的扩增与测序

根据水稻日本晴基因组的注释(http://rapdb.dna.affrc.go.jp)，对定位区间内的候选基因设计PCR引物(见表2)，使用PrimeSTAR®HS DNA Polymerase试剂盒(TaKaRa公司，日本)对野生型对照镇恢084和els-t突变体的基因组DNA进行PCR扩增，程序为：95 ℃预变性 5 min；98 ℃变性10 s，58 ℃退火5 s，72 ℃复性 90 s，35个循环；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存.PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，寄送生物技术公司进行测序.

表2 Os03g0265100基因的PCR引物序列

2 结果与分析

2.1 水稻els-t突变体表现为叶片早衰及生长发育受影响

水稻els-t突变体从分蘖期开始出现早衰表型，叶尖首先黄化，随后整个叶片逐渐枯黄，而对照叶片还未出现任何衰老的迹象(见图1a).进一步对els-t突变体正常叶片的光响应曲线进行了测定，发现els-t突变体的暗呼吸速率(光照强度为0 时)与同时期的对照叶片相近；但是，随着光照强度的增强，els-t突变体达到光补偿点和光饱和点都比对照延迟了，而且els-t突变体的净光合速率也比对照显著性下降(见图1b).以上结果表明，els-t突变体对光的响应能力及其光合作用效率均低于对照.同时，将els-t突变体的正常叶片与同时期的对照叶片进行黑暗处理，并测定了其叶绿素含量的变化，结果显示，处理前二者的叶色与绿色含量没有差异，而经过黑暗处理后，els-t突变体的叶片明显比对照更黄(见图1c)，其叶片的叶绿素含量也比对照下降得更快(见图1d).这表明在黑暗条件下，els-t突变体叶片中叶绿素的降解速率比对照更快.对els-t突变体的农艺性状统计调查发现，其穗长、每穗粒数、结实率、千粒质量和单株产量等产量相关的重要性状均比对照显著性下降(见图2).

a：分蘖期的植株表型；b：分蘖期叶片的光响应曲线；c：暗处理后叶片的表型；d：暗处理后叶片的叶绿素含量变化对照：野生型对照镇恢084；els-t：els-t突变体.“**”表示对照与els-t之间存在显著性差异(P<0.01)

箱形图显示中间值(线)和异常值(黑点).“**”表示野生型对照镇恢084与突变体之间存在显著性差异(P<0.01)

2.2 水稻els-t突变体的早衰表型受单隐性核基因控制

以els-t突变体为母本与野生型镇恢084(籼稻)杂交，F1代自交获得F2代群体.F1代植株为野生型，F2代群体(3 835单株)出现了表型分离，其中野生型2 918株，早衰突变型917株，经χ2检验该群体的野生型与突变型的分离符合3∶1(见表3).同时，以els-t突变体为母本与野生型日本晴(籼稻)杂交，其F1代植株也为野生型，自交F2代群体的野生型与早衰突变型的分离比也符合3∶1(见表3).这些结果表明，els-t突变体的早衰表型由单隐性核基因控制.

表3 水稻els-t 突变体与野生型杂交F2代群体的表型及分离比

2.3 水稻els-t 基因被精细定位于3号染色体的48 kb区间

利用els-t突变体与日本晴杂交构建的F2代群体，用覆盖水稻基因组、在两个亲本间具有多态性的92个分子标记进行了连锁分析，结果见图3，图中“n”表示用于分析的F2突变单株数目，分子标记下对应的数字表示该标记与目的基因间发生染色体交换的单株个数.首先将目的基因确定在水稻3号染色体上，并利用100个F2突变单株将els-t基因初步定位在标记RM14635和RM14766之间，物理距离为3.0 Mb(见图3a).随后，在这两个标记之间筛选出了6个多态性分子标记，通过扩大F2突变单株数目至1 585株，进一步将目的基因精细定位在InDel3与InDel4两个标记之间，物理距离为48 kb(见图3b).

a：els-t基因初定位的遗传图谱；b：els-t基因精细定位的遗传图谱；c：els-t基因结构及其突变位点；d：日本晴与els-t突变体杂交F2代植株的突变位点测序结果

2.4 水稻els-t 为早衰调控基因PLS2的一个新等位突变

根据水稻日本晴基因组的注释，在48 kb的基因定位区内含有9个基因.通过PCR对这些基因的测序分析，与野生型镇恢084的序列进行比较，发现其中1个基因Os03g0265100的第5个外显子中发生1个碱基A缺失(见图3c).为了进一步证明该碱基的缺失导致了els-t突变体出现早衰表型，从F2代群体中随机选取20个野生型和20个早衰突变型单株，对该突变位点进行PCR扩增和测序.结果发现，野生型单株的基因型为无突变(野生型)、或单染色体突变(野生型/A缺失)，而早衰突变型单株则全部为纯合突变(A缺失)，代表性的测序结果如图3d所示.在图3d中，左侧表示植株表型，右侧表示Os03g0265100的基因型，野生型表示无突变，野生型/A缺失表示单染色发生碱基A缺失，A缺失表示双染色体发生碱基A缺失的纯合突变.基因Os03g0265100是一个曾被报道参与水稻早衰调控的基因PLS2(prematureleafsenescence2)，els-t是其新的等位突变[31].

3 讨 论

叶片衰老是植物生长发育的必然进程，也是植物对环境的一种适应性.然而，叶片过早的衰老会降低光合作用的效率进而影响作物的生物量合成[32].目前，水稻中已经鉴定的叶片早衰突变体有很多，其中esl3，esl6和es5等突变体在苗期出现叶片早衰表型[33-35]，esl9，mps1和g398等突变体在分蘖期出现叶片早衰表型[35-37]，es-h等突变体在抽穗后叶片出现早衰表型[38].虽然，这些水稻早衰突变体衰老发生的时期不同，但在其叶片衰老过程中，叶片的叶绿素含量都会显著下降，并且主要农艺性状每穗粒数和单株产量等都显著降低.水稻els-t突变体也具有相似的表型，在分蘖期时开始出现叶片衰老，其光合作用的效率也显著低于野生型对照.由于水稻营养物质的积累主要来源于叶片的光合作用，因此其与产量相关的农艺性状也显著性下降.

通过对els-t突变基因的精细定位和候选基因的PCR测序研究发现，els-t是曾被报道参与水稻早衰调控的基因PLS2[31]的一个新的等位突变，其第5个外显子的第61位A碱基缺失，造成移码突变.而曾被报道的pls2突变体，其第9个外显子上第41位的C碱基被替换为T碱基，导致精氨酸被半胱氨酸所替换引发早衰表型，株高、每穗粒数、千粒质量和单株产量等农艺性状也显著降低[31].移码突变往往导致基因的功能缺失，往往比碱基替换引发的效应更加严重.尽管els-t突变体的多项农艺性状发生下降，但是其株高却没有显著变化，这点与株高明显下降的pls2突变体不同.这可能是因为基因缺失只会导致PLS2蛋白质失去原有的功能，而碱基替换导致的精氨酸到半胱氨酸的替换可能影响了PLS2蛋白质的高级结构，使得PLS2蛋白质的功能发生改变，抑制了水稻的正常生长.这种通过碱基替换导致功能发生改变的突变形式可以为蛋白质高级结构与其功能之间关系的研究提供了新的思路.

PLS2基因编码一个糖基转移酶，它在参与生物合成、保持内部环境稳态，调控信号分子和防御化合物的活性中起着重要的作用.依赖UDP的糖基转移酶可以催化糖从活性糖供体转移到小分子受体上，进而形成糖苷键.已有的研究表明，糖基转移酶在植株抗性及植株衰老等过程中发挥着一定的作用.在拟南芥中，过表达豌豆的PsUGT1基因会导致植株叶片衰老加快[39]，而沉默AtUGT85A7的拟南芥叶片衰老速度会延迟[39].然而糖基转移酶在水稻叶片衰老中是如何发挥作用的尚不明确，以上研究结果为糖代谢异常导致叶片衰老提供了一个新的遗传材料.