固原乌鸡肠道黑色素的形态特征及分布规律

王雪容，叶宇恒，广怡静，何小强，张 莉

（宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750021）

固原乌鸡是采用现代家禽育种技术选择培育而成，同时兼有固原土种乌鸡与国际标准品种乌鸡优点的优良品种。它适合在固原市乃至整个北方地区自然条件下饲养。固原乌鸡具有耐寒、耐潮湿、耐粗饲料、适应力强、肉质鲜美等特点，是集食用、药用、观赏为一体的白、黑、麻3个羽色的固原新的乌鸡类群[1]。乌骨鸡的鸡肉所含胆固醇水平低、游离脂肪酸高、微量元素丰富，同时还含有大量人体所必需的氨基酸，营养价值、观赏价值与医疗价值很高[2]。乌骨鸡鸡肉中还含有很多具有一定抗氧化能力和较强清除羟自由基能力的活性肽[3]。乌骨鸡鸡蛋中含有较多的花生四烯酸，其蛋黄干比例与蛋黄物质比例高于普通鸡蛋[4]。除此之外，大量黑色素存在于固原乌鸡体内。已有试验表明，在动物体内黑色素具有很多重要功能，例如抗氧化、抑制病毒增殖、保护DNA和线粒体、体温调节、射线保护等[5]。因此，现阶段认为乌骨鸡发挥药效作用的物质基础是黑色素。

近年来，随着人们生活水平的不断提高，其对食物的要求也随之提高，绿色健康食品成为首选，具有药用、蛋用、肉用三位一体效用的乌骨鸡能够满足市场需求。现阶段对固原乌鸡的研究多集中在营养和形态方面，而对固原乌鸡肠道内黑色素的形态结构和分布规律等方面的研究较少。本研究旨在通过分析固原乌鸡肠道黑色素颗粒的位置与特征，为丰富乌骨鸡黑色素沉积原理提供更多理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

安乐死后快速解剖6只健康白羽固原乌鸡，依次取出十二指肠、空肠、回肠、盲肠，肠内容物用0.9%生理盐水清洗，用10%甲醛溶液固定小块组织样本。

1.2 试验方法

1.2.1 制作石蜡切片 从固定液中取出肠道组织样本，分级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡浸泡，石蜡包裹，切割石蜡（YD-1508，浙江益迪），5 μm厚。将切片放入42 ℃温水中进行水浴使之展开，再用载玻片将切片捞出，在37 ℃温箱中干燥以备后期使用。

1.2.2 苏木精-伊红（HE）染色 用二甲苯将切片进行脱蜡，苏木精溶液中染色10～20 min，自来水冲洗1～3 min，盐酸酒精分化5～10 s，自来水冲洗1～3 min，放入50 ℃温水中或弱碱水溶液中返蓝，直到出现蓝色为止，自来水冲洗1～3 min，放入85%的酒精3～5 min，伊红染色3～5 min，水洗3～5 s，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.2.3 Masson-Fontana组织化学染色法 把肠道组织切片置于二甲苯中脱石蜡，用梯度乙醇使切片重新恢复成有水分的状态，氨-银染色（氨银液：100 g/L硝酸银水溶液+280 g/L氨水）24 h；用蒸馏水冲洗，然后把切片置于5%硫代硫酸钠水溶液处理2 min；用蒸馏水冲洗，1%中性红染2 min；再用蒸馏水冲洗，分级乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶密封切片，使用BM2000型光学显微镜（日本尼康）进行观察，最后以照片形式记录。

2 结果

2.1 固原乌鸡十二指肠显微结构

通过观察镜下结构可发现十二指肠肠壁组织结构由外向内分为4层，即外膜、肌层、黏膜下层与黏膜（图1），分层较为明显。十二指肠肠绒毛较长，黏膜层上皮细胞中杯状细胞数量较多（图1A），大量淋巴细胞见于固有层内。十二指肠的肌层分为环行平滑肌层（位于内侧）和纵行平滑肌层（位于外侧），其中黑色素主要分布在纵行平滑肌中，数量较少（图1B）；浆膜中黑色素也有较少分布。Masson-Fontana染色结果显示，十二指肠黑色素颗粒较少（图1C），大多沉积在肌层与浆膜之间，少数散在分布于肌层的纵行平滑肌层内。

图1 固原乌鸡十二指肠显微镜结构

2.2 固原乌鸡空肠显微结构

空肠肠壁组织结构同样分为4层（图2），分层较为明显，肠绒毛密集，黏膜上皮杯状细胞较多（图2D），固有层内可见少量淋巴细胞。空肠肌层中环行平滑肌和纵行平滑肌都未观察到黑色素分布，浆膜中黑色素数量分布中等（图2E），主要靠近肌层。Masson-Fontana染色结果显示：空肠黑色素颗粒也较多，主要沉积在浆膜中，肌层中未观察到黑色颗粒（图2F），与HE染色结果一致。

图2 固原乌鸡空肠显微镜结构

2.3 固原乌鸡回肠显微结构

回肠肠壁组织分为黏膜层、黏膜下层、肌层与外膜（图3），分层较为明显，肠绒毛较长，黏膜层上皮细胞中杯状细胞数量较少，固有层内可见少量淋巴细胞。回肠肌层可见大量黑色素分布，主要沉着在纵行平滑肌中，靠近大血管周围和外膜的边缘附近有黑色颗粒附着，浆膜内可见少量黑色素沉积（图3H）。Masson-Fontana染色结果显示：回肠黑色素颗粒较多，大多沉积在肌层与外膜之间，少数分布于肌层与浆膜内（图3G）。

图3 固原乌鸡回肠显微镜结构

2.4 固原乌鸡盲肠显微结构

盲肠肠壁组织分为黏膜层、黏膜下层、肌层与外膜（图4），分层较为明显，肠腔变平坦，肠绒毛较短，有散在的淋巴结分布，肌层最发达（图4K）。盲肠肌层中环行平滑肌中黑色素很少，可见零星分布，但纵行平滑肌中有大量黑色素沉着，很多黑色素细胞聚集成片状分布，浆膜有较少的黑色素沉积（图4N）。Masson-Fontana染色结果显示：盲肠黑色素颗粒较多，肌层与外膜间有大量黑色素沉积，少数黑色素颗粒散在分布于肌层与浆膜内（图4O）。

图4 固原乌鸡盲肠显微镜结构

本试验中肠道内均可见不等量黑色素沉积，黑色素的分布和含量见表1，主要沉着于肌层和浆膜层，而黏膜和黏膜下层很少，回肠和盲肠含量较多，空肠较少。

表1 固原乌鸡肠道黑色素的分布位置及含量

3 讨论

Korakot Nganvongpanit等[6]通过研究泰国乌骨鸡体内黑色素在33个器官中的分布，发现性别对乌骨鸡各器官的色素沉着没有影响，部分鸡的器官或组织样本，如心脏、肾脏和腹部脂肪，未显示出任何程度的色素沉着。Guo Hui等[7]采用lily染色、DOPA染色和透射电镜观察泰和乌骨鸡皮肤黑素细胞的分布特征，发现成熟的黑素细胞主要分布在表皮基底层和毛囊鳞茎中，而无色黑素细胞主要分布在毛囊外根鞘中，在成熟的黑素细胞中，黑素小体分为I、II、Ⅲ、IV期，大部分属于IV期。有研究表明，黑色素细胞于皮肤中发育成熟，成熟的黑色素细胞大多位于毛囊中，表皮层的基底部只有少数存在。黑色素小体是一种可以产生黑色素的细胞器，它存在于成熟的黑色素细胞中。黑色素合成后会运输到固定区域沉积。乌骨鸡胚胎发育5 d左右时，黑色素首先出现在鸡胚的背部皮肤中，然后以背部为中心，分别向四周拓展。黑色素的沉积顺序为首先在骨膜肌膜和皮肤中，接着在肌间结缔组织，最后在肌纤维组织[8]。

国外一项针对泰国乌骨鸡的研究表明[6]，在一些器官中，组织样本的所有结构层中都发现了黑色素。但仅在气管、泄殖腔、输卵管等组织样本的某些层中观察到了黑色素，而在上皮层中未发现黑色素。食管组织中，仅在浆膜中有黑色素沉着。嗉囊、盲肠和空肠组织中黏膜和黏膜下层未发现黑色素，而黑色素主要沉积在肌层和浆膜中。国内针对泰和乌骨鸡肠道黑色素分布特征的研究结果表明，泰和乌骨鸡肠道有黑色素分布，且多分布于肌层与浆膜间[9]。泰和乌骨鸡的研究中，大多数黑色素细胞主要存在于血管附近和肠道的肌肉层和外膜中[10]。本次试验中，苏木精-伊红染色结果表明固原乌鸡肠道组织结构与普通品种鸡基本相似。十二指肠、空肠、回肠与盲肠肠壁均分为黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜，且分层较为明显。空肠、回肠和十二指肠肠绒毛较长，黏膜上皮杯状细胞较多，固有层内可见有少量淋巴细胞；而盲肠的肠绒毛较短，大量淋巴细胞聚集于固有层内。黑色素沉积于十二指肠、空肠、回肠和盲肠肌层结缔组织及浆膜内，且回肠、十二指肠和盲肠较多，空肠较少。Masson-Fontana组织化学染色法结果同样显示固原乌鸡以上几种肠道黑色素沉积于肌层结缔组织及浆膜内，且回肠、十二指肠和盲肠较多，空肠较少。本次试验通过形态学方法探索固原乌鸡肠道分布特征及规律，旨在丰富乌鸡黑色素研究理论，为进一步研究黑色素的形成、分布、功能等提供更多依据。

固原乌鸡黑色素分布于十二指肠、空肠、回肠与盲肠中，表明黑色素在这些肠道中可能具有一定的生理作用，如抗寄生虫、抗病毒、抗炎症、免疫调节和抗氧化等[5]。因此，肠道肌层与浆膜内的黑色素颗粒层可能对微生物或寄生虫的侵入具有一定的免疫保护作用。而在固原乌鸡中十二指肠、回肠与盲肠的黑色素较多，空肠黑色素较少的原因可能与不同肠道组织功能不同有一定关系，具体原因有待进一步研究论证。