夜来香花提取物对肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤生长及凋亡的影响

卢红梅

（广西农业职业技术大学，广西 南宁 530007）

夜来香又名夜香树，药用资源非常丰富。前人在体外抗肿瘤研究中发现夜来香提取物具有抗肿瘤作用。目前，对夜香树花进行体内抗肿瘤作用方面研究较少。本研究旨在探讨夜来香花提取物对肝癌H荷瘤小鼠肿瘤增殖的影响作用，以及对肝癌H细胞周期和细胞凋亡的影响，为继续研究提供依据。

1 实验材料

1.1 动物

昆明种小鼠，SPF级，数量60只，雌雄各半，每只体重为18~22 g，购买自右江民族医学院实验动物中心。

1.2 细胞株

肝癌细胞H购买于上海细胞生物学研究所。

1.3 药物与试剂

夜来香花提取物（自制），95%乙醇（Ethanol，山东新泰胜源消毒剂有限公司），Rnase（核糖核酸酶，美国sigma试剂公司），环磷酰胺（CTX，江苏盛迪亚生物医药有限公司），PI（碘化丙啶，美国sigma试剂公司），PBS缓冲液（福州飞净生物科技有限公司）。

1.4 仪器

旋转蒸发仪（型号RE-2000E，郑州华特仪器设备有限公司），电子分析天平（型号AG135，瑞士产），流式细胞检测仪（型号Epricsxl，美国产），离心机（TDL-50B，上海安亭科学仪器厂），冷冻干燥机（ALPHAl-2/LD-Puls，德国CHRIST公司产），循环水式真空泵（型号SHB，郑州长城科工贸有限公司）。

2 实验方法

2.1 夜来香花提取物的提取制备

夜来香花采摘于广西境内，晒干，65%乙醇浸泡3天，浸泡液放置在圆底烧瓶中，用回流提取方式提取2次，每次2 h。循环水式真空泵进行减压抽滤，合并两次的过滤液，将过滤液进行减压蒸馏，浓缩得提取物浓稠膏，再用冷冻干燥机干燥得夜来香花提取物的浸膏粉。称取浸膏粉，用生理盐水来溶解和稀释，设计并配制三组等比增大的不同剂量给药组，小剂量组为160 mg/kg，中剂量组为320 mg/kg，大剂量组为640 mg/kg。

2.2 肝癌H22荷瘤小鼠模型的建立

接种肝癌H细胞于小鼠腹部，正常喂养，8天后选择生长良好的小鼠，腹部用酒精消毒后抽取出腹水，抽出的腹水若有大量红细胞或颜色呈黄色时视为不合格，应弃去不用，合格的腹水应为无絮状沉淀的乳白色的浓稠液体。于载玻片上滴一滴腹水，瑞氏染色，镜下计数瘤细胞数量大于95%。再用无菌生理盐水按1∶4的比例把腹水稀释成瘤细胞悬液，于左前支腋窝皮下每只小鼠接种0.2 mL瘤细胞悬液。

2.3 对肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

一天后，选择造模成功的荷瘤小鼠60只，按体重把小鼠随机并平均分成5组，每组雌雄数量各占一半，5组分别为阴性对照组（生理盐水组）、阳性对照组（环磷酰胺组）及夜来香花提取物小剂量组、中剂量组、大剂量组。生理盐水组给予30 mg/kg，环磷酰胺组给予30 mg/kg（用生理盐水稀释），小剂量组给予160 mg/kg、中剂量组给予320 mg/kg、大剂量组给予640 mg/kg夜来香花提取物，灌胃给药，每天1次，连续给药8天。第9天采用颈椎脱臼法处死小鼠，立即剥出小鼠右腋下的瘤块，要求剥离干净，并称量瘤块重量，按下列公式计算瘤块抑制率：肿瘤抑制率（%）=（1- 给药组平均肿瘤重量/空白组平均肿瘤重量）×100%。

2.4 流式细胞检测仪测定H22细胞周期及其凋亡率

称量瘤块重量后，每组取瘤块用剪刀剪碎，制配成H肿瘤细胞悬液。尼龙网（200目）过滤，离心机调节转速为每分钟1500转，共离心2次，每次5 min，瘤细胞悬液调配成每升含1.2×10个的浓度。取0.5 mL瘤细胞悬液放入70%乙醇（4 ℃、500 μL）中固定。第2天，在4℃和每分钟1500转的转速下离心5 min，去除固定液，加入500 μL PBS 缓冲液重悬细胞，每管加 Rnase（5 μL、10 mg/mL），37 ℃水浴25 min，再用200目筛过滤除去粘连细胞，加入终浓度为50 μg/mL PI染液，温室中染色约30 min。用FCM测定H细胞周期各时相细胞的比例和凋亡细胞。

2.5 统计学处理

3 实验结果

3.1 对肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

夜来香花提取物对H荷瘤小鼠肿瘤生长影响的实验结果见表1。阳性对照组和夜来香花提取物的小剂量组、中剂量组、大剂量组与阴性对照组相比较，抑瘤率均有提高，其中夜来香花提取物的中剂量组、大剂量组肿瘤抑制率分别达到了40.17%、50.85%，差异非常显著（均＜0.01），均有统计学意义，且随着给药量的加大，3个剂量组对肝癌H荷瘤小鼠的肿瘤生长抑制率逐渐增强，与剂量呈正相关。

表1 夜来香花提取物对H22荷瘤小鼠肿瘤生长影响的实验结果（±s）

3.2 对H22细胞周期和凋亡的影响

夜来香花提取物对H细胞周期和凋亡的影响见表2。夜来香花提取物的中剂量组、大剂量组对肝癌H细胞周期作用较为明显。中剂量组的G/G期细胞从32.3%提高到56.5%，S期细胞从58.5%下调到19.0%，G/M期细胞从9.2%提高到24.5%，其凋亡率为27.8%，与阴性对照组比较有显著性差异（均＜0.05），差异有统计学意义。大剂量组的GG期细胞从32.3%提高到61.2%，S期细胞从58.5%下调到14.9%，G/M期细胞从9.2%提高到23.9%，其凋亡率也较高，为33.5%，与阴性对照组比较有显著性差异（均＜0.05），差异有统计学意义。G/G期和G/M期的细胞增多，而S期的减少。

表2 夜来香花提取物对H22细胞周期和凋亡的影响

4 讨论

目前恶性肿瘤已经成为一些地区人类死亡的主要原因，每年全世界大约有760万人死于恶性肿瘤。在我国，恶性肿瘤在死因中排第2位，在城市已排首位。全国每年大约有新发病例200万，死亡150万人。肝癌在我国男性恶性肿瘤发病率中居第3位，在我国女性恶性肿瘤发病率中居第5位。由于肝癌发展快，易转移和复发，病死率很高，近年来发病率有上升的趋势，对患者危害大，因此探索肝癌的防治方法是当前医药研究的重要方向。

根据实体瘤疗效评价标准，肿瘤抑制率＜40%为无疗效；肿瘤抑制率≥40%，并经统计学分析有显著性差异时，认为该药有一定的疗效，实验需重复1次以确定疗效。本实验中夜来香花提取物中剂量组、大剂量组抑瘤率分别达到了40.17%、50.85%，相比阴性对照组均具有显著性差异（均＜0.01），差异均有统计学意义，且随着给药量的加大，3个剂量组的肿瘤生长抑制率逐渐增强，与剂量呈正相关，显示其对小鼠肝癌H细胞的生长增殖有较好的抑制作用。

细胞凋亡是一种由基因调控的细胞主动死亡过程，是机体的正常细胞在受到生理或病理刺激后启动的一种主动死亡过程，抗肿瘤药物作用大多数通过各种细胞因子或药物诱导敏感肿瘤细胞发生凋亡从而实现其抑瘤作用。流式细胞检测仪检测结果表明，夜来香花提取物中剂量组、大剂量组对H细胞周期影响明显，凋亡率也较高，分别为27.8%、33.5%，与阴性对照组比较差异显著（均＜0.05），均具有统计学意义。究其原因可能是通过阻断肝癌H细胞由G/ G期进入S期，从而诱导细胞凋亡。

综上所述，夜来香花提取物抑制小鼠体内H细胞生长增殖可能与诱导细胞凋亡有关。本实验为夜香树花将来的继续研究、开发和利用提供一定的理论依据。