大蒜心腐病菌室内防治药剂筛选

赵永强.杨峰.陆信娟.刘灿玉.张碧薇.杨青青.葛洁.史新敏.樊继德

（江苏徐淮地区徐州农业科学研究所，江苏 徐州 221121）

大蒜（L.）是一种重要的调味类蔬菜，同时也是一种具有保健功能的特殊食品，深受我国消费者欢迎。目前，我国大蒜产区主要集中在山东省、江苏省和河南省，种植面积逐渐扩大。近年来随着大蒜种植收益的提高，我国大蒜主产区连种年限逐渐延长，各种病虫害发生日益严重，特别是大蒜心腐病的为害逐年加重，严重影响大蒜产量和品质。

大蒜心腐病是一种由细菌侵染引起的病害，2002年首先在江苏盐城、太仓的大蒜田发现，并由胡白石等人将其病原细菌鉴定并暂命名为荧光假单胞菌葱属致病变种（pv.Hu et Xu）。大蒜受到该病菌侵染后表现为生理性失调，植株生长受挫、畸形，叶片自叶尖向里变红褐色。病菌首先感染茎盘基部，产生褐色病斑，病斑逐渐向上扩展到叶片组织，导致茎盘和假茎由内而外腐烂，并散发出鱼腥味恶臭。

目前，大蒜心腐病仅在我国报道发生，受关注较少，且尚未有关于该病害防控技术方面的研究报道。为了促进对大蒜心腐病防控技术的研究，本团队选择了抗生素类、噻二唑类和有机铜类等三类杀菌剂中对细菌性病害有防治效果的药剂14种，进行大蒜心腐病菌室内防治药剂筛选，以期为大蒜心腐病菌的有效防控提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试大蒜心腐病菌菌株由本实验室分离并保存，该菌株分离于江苏省邳州市宿羊山镇大蒜心腐病典型症状植株，采集日期为2019年3月27日，菌株经过3次单菌落纯化、致病性验证和16S序列比对。

1.2 供试药剂

选取了三类市售的细菌性杀菌剂共计14种，包括（1）抗生素类杀菌剂：0.3%四霉素水剂（辽宁微科生物工程有限公司）、3%中生菌素可湿性粉剂（深圳诺普信农化股份有限公司）、2%春雷霉素水剂（日本北兴化学工业株式会社）、8%宁南霉素水剂（德强生物股份有限公司）、72%农用链霉素可湿性粉剂（成都普惠生物工程有限公司）；（2）噻二唑类杀菌剂：30%噻唑锌悬浮剂（浙江新农化工股份有限公司）、60%叶枯唑粉剂（北美农大集团）；（3）有机铜类杀菌剂：30%壬菌铜微乳剂（西安近代科技实业有限公司）、15%络氨铜水剂（天津博克百胜科技有限公司）、30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂（齐齐哈尔四友化工有限公司）、23%松脂酸铜乳油（山东禾宜生物科技有限公司）、20%噻菌铜悬浮剂（浙江龙湾化工有限公司）、33.5%喹啉铜悬浮剂［兴农药业（中国）有限公司］、20%噻森铜悬浮剂（浙江东风化工有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 供试菌株准备

于试验前1 d将大蒜心腐病菌接种到LB液体培养基，置于恒温摇床28℃活化12 h左右。用无菌水调配菌液浓度为1×10CFU/mL。

1.3.2 药剂配制

根据预试验结果，用LB液体培养基配制各参试药剂高浓度母液（按照各药剂活性成分计算）：8%宁南霉素水剂、23%松脂酸铜乳油、72%农用链霉素可湿性粉剂、20%噻森铜悬浮剂、33.5%喹啉铜悬浮剂、20%噻菌铜悬浮剂51200 mg/L，0.3%四霉素水剂、3%中生菌素可湿性粉剂、2%春雷霉素水剂、30%噻唑锌悬浮剂、60%叶枯唑粉剂、30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂、30%壬菌铜微乳剂、15%络氨铜水剂1600 mg/L。

1.3.3 参试药剂对大蒜心腐病菌最低有效抑菌浓度（MIC）测定

参试药剂MIC的测定采用含毒介质法：将500 μL大蒜心腐病菌悬液加入到20 mL LB液体培养基中，摇匀。取灭菌细胞培养板，每个孔内加入上述LB液体培养基200 μL。将200 μL高浓度药剂母液加入细胞培养板A排孔内，混匀，按比例吸取混合后的药液加入B排孔，依次操作到G排孔为止。将H排孔设置为空白对照，加入等量无菌LB液体培养基，混匀。弃掉各孔内多余混合液，使各个孔内的混合液体积保留200 μL，各药剂设3次重复。将细胞培养板置于培养箱内28℃恒温培养，待空白对照混合液出现浑浊，将各孔混合液再次混匀后，吸取20 μL加入到新的灭菌培养板对应孔内，孔内预先加入180 μL无菌LB液体培养基，重新置于培养箱中培养，待空白对照混合液再次出现浑浊，观察比较结果。

1.3.4 活性药剂对大蒜心腐病菌抑菌效果测定

根据MIC值测定结果，选取对大蒜心腐病菌有抑菌活性的药剂，采用抑菌圈法测定其抑菌效果。选取药剂的参试浓度设置为：0.3%四霉素水剂200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L；3%中生菌素可湿性粉剂600 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L；2% 春 雷 霉 素水剂800 mg/L、600 mg/L、400 mg/L、200 mg/L、100 mg/L；30% 噻唑锌悬浮剂、15%络氨铜水剂、60%叶枯唑粉剂、30%壬菌铜微乳剂、30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂2400 mg/L、2000 mg/L、1600 mg/L、1200 mg/L、800 mg/L；23%松脂酸铜乳油16000 mg/L、12800 mg/L、9600 mg/L、6400 mg/L、3200 mg/L；8%宁南霉素水剂22400 mg/L、19200 mg/L、16000 mg/L、12800 mg/L、9600 mg/L。药剂用无菌水稀释。

1.3.5 盆栽验证四霉素水剂对大蒜心腐病的防治效果

选择四霉素水剂进行盆栽防治试验，用量参照花生拌种推荐浓度160 mL·100 kg种子。选择大蒜品种“徐蒜6号”为参试品种，挑选大小较为一致的蒜瓣，清水浸泡约15 h，取出沥干水分，四霉素药剂拌种，清水作为对照，处理后蒜瓣种植于花盆中，每盆均匀播种20个，每处理各栽种6盆。蒜瓣覆土前，各浇施菌悬液1 mL。花盆置于人工气候室26℃、12 h/12 h光暗交替培养，分别于栽种后12 d和36 d按植株病情分级记录心腐病发生情况，计算病情指数及防治效果。

大蒜植株心腐病发病情况调查时，横向切去大蒜植株茎盘底部1～2 mm，按照茎盘基部剖面病斑面积占剖面总面积的百分比将病情分为5级。

0级：茎盘剖面无病斑；

1级：茎盘剖面病斑面积＜25%；

3级：25%≤茎盘剖面病斑面积＜50%；

5级：50%≤茎盘剖面病斑面积＜75%；

7级：茎盘剖面病斑面积≥75%。

病情指数计算公式为：

1.4 数据处理

数据的整理与分析采用软件 Microsoft Office Excel 2007 完成 。

2 结果与分析

2.1 参试药剂对大蒜心腐病菌最低有效抑菌浓度（MIC）

参试药剂对大蒜心腐病菌MIC测定结果如表1所示，供试的14种药剂中0.3%四霉素水剂、3%中生菌素可湿性粉剂、2%春雷霉素水剂、30%噻唑锌悬浮剂、30%壬菌铜微乳剂、15%络氨铜水剂、30%琥胶肥酸铜可湿性粉剂、60%叶枯唑粉剂、23%松脂酸铜乳油、8%宁南霉素水剂等10种药剂在参试浓度范围内对大蒜心腐病菌有抑制效果。其中，抑菌活性最高的是0.3%四霉素水剂、3%中生菌素可湿性粉剂和2%春雷霉素水剂，MIC分别为0.20 mg/L、50.00 mg/L和100.00 mg/L。20%噻菌铜悬浮剂、72%农用链霉素可湿性粉剂、33.5%喹啉铜悬浮剂、20%噻森铜悬浮剂等4种药剂在有效成分浓度25600.00 mg/L时仍无抑菌效果。

表1 参试药剂对大蒜心腐病菌MIC测定结果

2.2 活性药剂对大蒜心腐病菌的抑菌效果

上述10种活性药剂对大蒜心腐病菌的抑菌效果测定表明，在参试浓度范围内仅0.3%四霉素水剂产生抑菌圈，且经3次重复验证均得到相同的结果。0.3%四霉素水剂200 mg/L、100 mg/L、50 mg/L、25 mg/L、12.5 mg/L处理产生的抑菌圈直径平均为2.26 cm、1.93 cm、1.35 cm、0.82 cm、0.44 cm。 以药剂浓度的对数为自变量，抑菌圈的平均直径为因变量，求出毒力回归方程为=0.6853-1.3208，=0.9926。

2.3 四霉素对大蒜心腐病的盆栽防治效果

四霉素水剂拌种对大蒜心腐病的防治效果如表2所示，四霉素水剂按照160 mL·100 kg大蒜种子的用量拌种，可以有效降低大蒜心腐病的发生，处理后12 d防治效果可达65.59%，但是随着时间的延长，其防治效果逐渐降低，处理后36 d的防治效果降为43.41%，降幅为33.82%。

表2 四霉素水剂拌种对大蒜心腐病的防治效果

3 讨论与结论

山东省、河南省和江苏省是我国大蒜三大优势产区，近年来三大主产区大蒜苗期“死苗”现象越来越严重，严重地块死苗率可达30%、感染率达到80%以上，给大蒜生产造成严重损失。根据本团队多年实地调查与研究发现，大蒜“死苗”现象主要是由细菌性病害大蒜心腐病和虫害蒜蛆、刺足根螨单独或共同为害引起。

本研究根据细菌性病害防治药剂类型特征，从抗生素类、噻二唑类和有机铜类等三类杀菌剂中选择对细菌性病害有防治效果的药剂14种，依次通过测定最低有效抑菌浓度、抑菌效果、盆栽防治效果等室内药剂筛选方法，确定四霉素水剂对大蒜心腐病菌具有较高的抑菌活性，并且盆栽条件下对大蒜心腐病也有较好的防治效果，可用于大蒜心腐病的防治。

虽然本研究结果表明，除四霉素水剂外其余13种药剂对大蒜心腐病菌的抑制效果较差，但是由于各药剂的作用机理不同，如噻菌铜悬乳剂等有机铜类杀菌剂并非直接作用于病原菌，在抑菌方面表现较差，但可能在大田有较好的防治效果。因此，需要通过更广泛的盆栽或田间试验，以进一步筛选大蒜心腐病适用药剂，从而可以轮换或复配使用，以达到提高防治效果和延缓抗药性产生的目的。