山芹菜金翠香梨混合果醋酿造工艺的研究

孙天利，程楚怡，杨涔，张晗，王虹玲

(沈阳工学院 生命工程学院，辽宁 抚顺 113122)

山芹菜，别名山芹、大叶芹，是一种遍布在中国北方地区的蔬菜，主要生长于辽宁、吉林、黑龙江等地的杂木林中或阔叶林下[1]。山芹菜营养价值较高，含有脂肪、蛋白质、碳水化合物、各种维生素等[2-5]。研究发现，山芹菜中的维生素C含量高出西芹5倍以上，胡萝卜素含量高出西芹38倍，维生素B2含量是十字花科植物大白菜和甘蓝的2倍以上[6]。另外，山芹菜中还富含多种微量元素，其中铁元素含量是一些常见蔬菜的10～30倍，对预防缺铁性贫血有一定的作用[7-9]。

金翠香梨是由雪花梨和庄河1号梨杂交选育而成的辽宁优良梨品种，果实均重200～400 g，最大的接近700 g[10-11]。金翠香梨香气浓郁，脆而多汁，果肉细腻，石细胞少，可溶性固形物含量达15%～18%[12-15]。金翠香梨富含纤维素、果糖等物质，易被人体吸收利用，且有润肠通便的作用[16-19]。另外，金翠香梨还具有一定的护肝、减缓疲劳、提高心肌活力等功效[20-24]。

山芹菜和金翠香梨都是东北地区的特产果蔬，分布广泛，产量高，但山芹菜常用于烹饪，金翠香梨则主要以鲜食为主，二者相关的深加工产品相对较少，经济价值较低。醋在我国有着上千年的历史，而混合果醋也是果品深加工的一个主流方向，即采用多种果蔬为原料，通过酿造制成醋类产品。混合果醋兼具醋和多种水果的风味，并且含有机酸、醇类、酯类、酚类等多种营养成分[25-30]。以山芹菜和金翠香梨为原料酿制的果醋营养丰富，口味独特，同时深加工极大地提高了两种原料的附加值，为山区特色食品的加工提供了一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

山芹菜、金翠香梨：市售；酿酒活性干酵母、蔗糖：安琪酵母股份有限公司；醋酸菌：山东济宁祥园生物科技有限公司；柠檬酸：河南硕之隆实业有限公司；果胶酶(30000 U/g)：山东隆科特酶制剂有限公司。

1.2 试剂

氢氧化钠(分析纯)：天津富宇精细化工有限公司；碳酸钙、硫酸铜(均为分析纯)：天津市致远化学试剂有限公司；壳聚糖：山东隆科特酶制剂有限公司；焦亚硫酸钾：山东中天生物科技有限公司。

1.3 仪器与设备

WZ-108型糖度计 浙江托普仪器有限公司；WBL2501B型榨汁机 美的集团有限公司；1645#型滴定管 泰州市环仪玻璃仪器有限公司；XLSC-100型酒精计 北京中西远大科技有限公司；FA2240型分析天平 常州幸运电子设备有限公司；HH-6型数显恒温水浴箱 常州国华电器有限公司；DNP-9082型电热恒温培养箱 上海精密试验设备有限公司。

1.4 方法

1.4.1 工艺流程

1.4.2 操作要点

1.4.2.1 山芹菜预处理

挑选新鲜且无病虫害的山芹菜，清洗干净后，于95 ℃的0.005 mol/L氢氧化钠溶液中烫漂3 min，然后在硫酸铜溶液中浸泡6 h，再将浸泡后的山芹菜在清水中流动冲洗10 min，最后以10%的比例加水榨汁并过滤。

1.4.2.2 金翠香梨预处理

选择品相良好、无病虫害的梨果，洗净后去皮去核，在500 mL蒸馏水中加入3 g柠檬酸，将预处理好的梨果放入加有柠檬酸的蒸馏水中浸泡5 min进行护色处理，然后对梨果进行榨汁，随后加入0.4%果胶酶酶解1 h后进行过滤。

1.4.2.3 混合调配、杀菌

将金翠香梨汁和山芹菜汁按比例混合后，在75 ℃下杀菌30 s，最后冷却降温。

1.4.2.4 酒精发酵

称量0.5%的酵母菌加入到2%的蔗糖溶液中，并在35 ℃下恒温水浴活化酵母菌20 min。将活化好的酵母菌溶液摇匀后依次加入到山芹菜和金翠香梨混合汁中，然后在30 ℃下恒温发酵10 d，得到山芹菜金翠香梨果酒。

1.4.2.5 醋酸发酵

将醋酸菌加入到山芹菜金翠香梨果酒中，在30 ℃下不断搅拌，直到绝大部分的醋酸菌完全溶解，再将搅拌好的果酒放入温度20～40 ℃、转速120 r/min的水浴锅中进行发酵，每日测定总酸含量。

1.4.2.6 澄清、杀菌、成品

在100 mL混合型果醋中添加浓度为1%的壳聚糖0.5 mL，并静置1.5 h，以达到澄清作用。将澄清后的山芹菜金翠香梨混合果醋于82 ℃下水浴20 min，然后迅速冷却至4～5 ℃，无菌灌装后即得山芹菜金翠香梨混合果醋成品。

1.4.3 单因素试验

以醋酸菌添加量(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/L)、发酵温度(20，25，30，35，40 ℃)、果蔬汁配比(梨汁∶山芹菜汁分别为1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1)、发酵时间(4，6，8，10，12 d)为主要因素，以酸度为评价指标，进行单因素试验，确定最优的单因素发酵条件。

1.4.4 响应面试验

在单因素试验的基础上，选择醋酸菌添加量(A)、发酵温度(B)、果蔬汁配比(C)和发酵时间(D)4个因素，以山芹菜金翠香梨混合果醋的总酸含量为响应值，进行响应面优化。试验条件优化响应面设计见表1。

表1 响应面试验因素与水平

1.4.5 理化指标测定

按照响应面法优化的酿造工艺进行山芹菜金翠香梨混合果醋的酿造，并对所酿造的果醋进行理化指标测定。

1.4.5.1 总酸含量的测定

参照GB/T 12456-2008中的酸度法(以乙酸计)。

1.4.5.2 菌落总数和大肠杆菌的测定

分别参照国标GB 4789.2-2016和GB 4789.3-2016中的方法。

2 结果与分析

2.1 山芹菜金翠香梨混合果醋发酵的单因素试验

2.1.1 醋酸菌添加量对醋酸发酵的影响

由图1可知，总酸含量随着醋酸菌添加量的增加呈现先升高后降低的趋势。当醋酸菌添加量达到0.4 g/L时，总酸含量达到最大值。随着醋酸菌添加量的增加，发酵越来越充分，产酸量逐渐增加。醋酸菌含量继续增加，总酸含量则呈现下降的趋势，分析认为，添加过量的醋酸菌使醋酸菌对营养物质的竞争激烈，不利于醋酸菌的生长繁殖，从而影响产酸量。因此，选择0.4 g/L为醋酸菌最适添加量。

图1 醋酸菌添加量对醋酸发酵的影响

2.1.2 发酵温度对醋酸发酵的影响

分别设定发酵温度为20，25，30，35，40 ℃，研究不同发酵温度对醋酸发酵的影响，对总酸含量进行测定并记录，结果见图2。

图2 发酵温度对醋酸发酵的影响

由图2可知，在山芹菜金翠香梨混合果醋的酿造过程中，发酵温度对混合果醋品质影响较大，总酸含量呈现先升高后降低的趋势。起初，随着发酵温度的升高，微生物活性逐渐增强，发酵产酸能力也增强，当温度达到30 ℃时，产酸量达到最大值；当温度超过30 ℃后，过高的温度反而使微生物活性受到抑制，甚至失活，发酵产酸能力下降。温度超过醋酸菌发酵的最适温度，使菌种活力降低，发酵能力降低。所以，选择30 ℃为最适发酵温度。

2.1.3 果蔬汁配比对醋酸发酵的影响

将梨汁与山芹菜汁按照1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1的比例混合，研究果蔬汁不同配比对醋酸发酵的影响，对总酸含量进行测定并记录，结果见图3。

图3 果蔬汁配比对醋酸发酵的影响

由图3可知，随着梨汁与山芹菜汁配比的增大，发酵产酸量逐渐升高，当配比为4∶1时，总酸含量达到最大值。配比中梨汁的含量越高，则发酵所能利用的碳源越足，发酵越充分。当梨汁与山芹菜汁配比为5∶1时，发酵总酸含量降低，分析认为，混合果蔬汁中含糖量过高，渗透压过大，反而抑制了菌种的活性，不利于发酵的进行。所以，果蔬汁的最佳配比为4∶1。

2.1.4 发酵时间对醋酸发酵的影响

分别设定复合果醋的发酵时间为4，6，8，10，12 d，对总酸含量进行测定并记录，结果见图4。

图4 发酵时间对醋酸发酵的影响

由图4可知，在山芹菜金翠香梨复合果醋的酿造过程中，随着时间的延长，醋酸菌发酵越来越充分，总酸含量逐渐升高，在第10天达到最大值。第10天后，总酸含量小幅降低，分析认为是少量醋酸挥发所致。所以，最佳发酵时间为10 d。

2.2 混合果醋生产工艺的响应面优化

2.2.1 回归模型的建立及方差分析

在单因素试验的基础上，采用Design Expert 10.0.3进行多元回归分析。以醋酸菌添加量(A)、发酵温度(B)、果蔬汁配比(C)和发酵时间(D)为主要因素，以总酸含量作为响应值，其分析方案与评分结果见表2，针对表2中的数据得到回归方程：

表2 响应面试验设计及结果

Y=6.02+0.037A+0.023B-0.014C+0.023D+0.008AB-0.065AC+0.038AD-0.018BC-0.045BD+0.04CD-0.11A2-0.032B2-0.064C2-0.12D2。

回归方程的方差分析结果见表3。

表3 回归模型方差分析

由表3可知，山芹菜金翠香梨混合果醋的总酸含量变化的回归模型变量关系极显著(P<0.01)，失拟项不显著(P>0.05)，说明选用的二次多项模型的拟合程度良好。试验模型的决定系数R2=0.9690，校正系数RAdj2=0.9380，表明回归方程相关性较好。变量A、B、D和交互项AC、AD、BD、CD以及各二次项对总酸含量的影响极显著(P<0.01)，变量C对总酸含量的影响显著(P<0.05)。影响山芹菜金翠香梨混合果醋总酸含量的排序为：果蔬汁配比(C)<发酵时间(D)<发酵温度(B)<醋酸菌添加量(A)。

2.2.2 响应面交互作用分析

各因素间的交互作用对果醋总酸含量的影响见图5～图8。

图5 醋酸菌添加量与果蔬汁配比的交互作用对总酸含量的响应面

图6 醋酸菌添加量与发酵时间的交互作用对总酸含量的响应面

图7 发酵温度与发酵时间的交互作用对总酸含量的响应面

图8 果蔬汁配比与发酵时间的交互作用对总酸含量的响应面

由图5～图8可知，A醋酸菌添加量与C果蔬汁配比、A醋酸菌添加量与D发酵时间、B发酵温度与D发酵时间、C果蔬汁配比与D发酵时间交互作用的三维图较陡，曲面变化较为明显，说明这几组因素的交互作用对果醋总酸含量的影响较大。

2.2.3 验证试验

通过响应面设计试验结果分析，当醋酸菌添加量为0.43 g/L、发酵温度为32.41 ℃、果蔬汁配比为3.68∶1、发酵时间为9.99 d时，总酸含量为6.04 g/dL，响应值达到理论最大值。为了使试验操作更简易可行，将最佳条件修改为醋酸菌添加量0.4 g/L、发酵温度32 ℃、果蔬汁配比4∶1、发酵时间10 d；为保证试验结果准确，进行3次验证试验，3次试验得到的果醋品质极佳，实际测量的总酸含量与响应面试验结果接近，平均总酸含量为5.97 g/dL，此试验值与理论值基本一致，因此本试验的模型拟合度高，数据真实可靠，可以作为山芹菜金翠香梨混合果醋酿造工艺的数据，以此为准进行混合果醋的生产加工。

2.3 微生物指标测定

以最佳试验条件酿造山芹菜金翠香梨混合果醋，并参照国家标准测定其微生物指标。结果显示，果醋的菌落总数≤100 CFU/mL，未检出大肠菌群和致病菌，产品微生物指标符合国家标准。

3 结论

通过响应面法确定了山芹菜金翠香梨混合果醋酿造的最佳工艺条件：醋酸菌添加量0.4 g/L、发酵温度32 ℃、果蔬汁配比4∶1、发酵时间10 d。在此工艺条件下得到的山芹菜金翠香梨混合果醋的总酸含量为5.97 g/dL，果醋色泽为淡棕色，醋体澄清透亮，醋香浓郁，风味独特，微生物指标符合国家标准。