系统性红斑狼疮患者血清学mRNA表达谱差异研究及生物信息学分析

张 静 （天津市第五中心医院皮肤科，天津 300450）

系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种以多系统损伤，并以血液中多种自身抗体产生和免疫复合物沉积为主要特征的自身免疫性疾病。SLE 发生与遗传背景下的感染因素、药物因素等密切相关［1］。针对部分患者靶点基因突变进行个体化生物治疗效果更为显著，进一步提示SLE的基因遗传机制在发病过程中起重要作用［2-3］。本文采用生物信息学方法分析目前数据库收录的SLE患者信息，筛选出显著差异表达、可能与SLE发病相关的核心基因并深入分析其功能，进一步探究SLE的遗传学机制，为SLE治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 数据来源 本研究共纳入38 例SLE 患者和32 例健康志愿者，所有样本基因表达谱数据来源于GEO 数据库，并基于 GPL16699 平台Agilent-039494 SurePrint G3 Human GE v2 8x60K芯片。

1.2 差异基因筛选 根据GPL16699 平台探针信息注释相应基因，采用R 软件（4.0.1）的scale 函数对基因表达矩阵进行归一化处理，采用limma 软件包分析差异表达基因，BH 方法对P值进行校正，选取 log2|Fold Change|>1.5 以及校正后P值（PBH）<0.05作为差异表达基因阈值。

1.3 功能富集分析 采用toppgene 在线工具对差异表达基因进行通路富集分析，以PBH<0.05 为阈值筛选显著富集的KEGG 和Reactome 生物学通路。采用 R 软件包 clusterProfiler（3.8.1）对差异表达基因进行GO 富集分析，以PBH<0.05 为阈值筛选显著富集的生物学过程（biological process，BP）和分子功能（molecular function，MF）。

1.4 基因互作网络分析 采用STRING 数据库建立差异表达基因相互作用网络。

2 结果

2.1 差异表达基因筛选 与健康对照组相比，SLE组39 个基因显著差异表达，其中38 个表达上调，1 个表达下调，TNFSF10 上调表达与 G0S2 下调表达的差异倍数最为显著，差异表达倍数分别为log2FC=1.52，PBH=3.48E-05和log2FC=−1.72，PBH=0.015。因39 个基因数量较少，选取log2|Fold Change|>1，P<0.05的383个基因表达情况进行可视化研究（图1）。

2.2 通路富集分析 以PBH<0.05 为阈值，共筛选到12 条显著富集的生物学通路（7 条Reactome 通路和5 条 KEGG 通路，表 1），多数通路与信号转导、病原体感染相关。

表1 差异表达基因显著富集的生物学通路Tab.1 Biological pathways with significant enrichment of differentially expressed genes

2.3 GO 富集分析 以PBH<0.05 为阈值，共筛选到24 条显著富集的 GO 条目（20 条 BP 条目和 4 条 MF条目），多数条目与病毒反应、干扰素反应、病毒基因组复制调控相关（图2）。

图2 差异表达基因显著富集的GOBP、GOMF条目Fig.2 GOBP and GOMF entries with significant enrich⁃ment of differentially expressed genes

2.4 基因相互作用网络构建 将39个差异表达基因映射到STRING 数据库的蛋白互作网络，共得到328条互作对（图1最内层轨道），单独显示上调表达最为显著的差异基因TNFSF10（黄色显示）网络节点图（图3），TNFSF10 与众多基因存在错综复杂的关系，且处于核心地位。而下调差异表达最为显著的基因G0S2 与本研究筛选出的其他差异基因无相互作用。提示TNFSF10 在SLE 中的作用比G0S2 更为关键。

图1 差异表达基因Fig.1 Differential expressed genes

图3 TNFSF10网络节点图Fig.3 TNFSF10 network node diagram

3 讨论

SLE 是一种具有广泛临床表现（包括皮疹、神经、精神症状、肌肉骨骼表现、狼疮性肾炎等）的经典自身免疫性疾病，在确诊和治疗过程中可随时伴发和继发其他多种疾病，如心肌炎、结核、Bowen 病等，严重威胁患者生命健康［4-6］。SLE 发病原因尚不清楚，目前关于Ⅰ型干扰素过度激活机制的研究较为广泛，而本研究筛选出的众多差异基因无论从生物学功能还是生物学通路方面均显示参与干扰素信号转导过程。同时大量基因也参与病原体感染过程，包括丙型肝炎、单纯疱疹、麻疹及流感等病毒反应。既往SLE病因学将感染因素和遗传因素作为并列因素讨论，但两者道路不同。全基因组关联显示SLE 患者有超过50 个基因位点变异，这些变异的位点多数涉及Ⅰ型干扰素系统，同时病原体可作为一种诱导物诱导并激活Ⅰ型干扰素产生，异常活化及增多的Ⅰ型干扰素通过调控免疫细胞活化及功能促进SLE发生发展［7］。

本研究中筛选出2 个表达差异最为显著的基因，分别为TNFSF10和G0S2。TNFSF10又名肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL），是 TNF 超家族重要成员。TRAIL 在免疫系统多种细胞，如 NK 细胞、T 细胞、树突状细胞和巨噬细胞中表达，并在免疫调节、病原抵抗、肿瘤监视等方面发挥重要作用。与健康对照组相比，SLE 患者外周血中此基因与其他多个关联基因的CG 位点甲基化具有显著差异，并可作为诊断学指标用于临床［8］。研究证实，SLE 患者血清中可溶性TRAIL（sTRAIL）平均浓度（936.0 pg/ml）高于类风湿关节炎患者（443.8 pg/ml）、韦格纳肉芽肿病患者（357.1 pg/ml）及健康对照组（509.4 pg/ml），且与血液中抗 ssa/ssb 抗体相关［9］。sTRAIL 在银屑病性关节炎患者中同样高表达，但与病情活动程度及临床表现无关，并被认为是SLE 血清学最具特征性的指标，可作为诊断依据［10］。SLE 的病理机制可能为TRAIL浓度增加及其受体TRAIL-R和TRAIL-R2表达增加，通过Fas/FasL（Fas 是一种跨膜蛋白，与FasL 结合启动凋亡信号转导引起细胞凋亡）系统引起单核细胞、淋巴细胞及中性粒细胞程序性凋亡，过多聚集的凋亡细胞碎片可能诱发自身免疫性疾病，包括SLE。文献证实，IFN 激活后刺激单核细胞活化，快速表达TRAIL，进一步引起细胞凋亡。通过DNA 微阵列分析TRAIL 介导的基因发现，TRAIL 凋亡信号通路可与IFN通路相互作用［11-13］。

G0S2是淋巴细胞凝集素诱导的细胞从G0~G1期转换过程中的重要基因，主要参与脂质合成代谢，同时通过调控MYC（最早发现的一组癌基因）转录抑制癌基因转化而作为保护因子存在［14-15］。但G0S2 与SLE 关系的研究较少，研究者发现SLE 患者及血管炎患者G0S2表达上调，并建立G0S2-TG小鼠（过表达人G0S2基因），发现此小鼠虽未出现血管炎症状，但并不健康，子代较少，且血液中抗dsDNA 和抗核抗体升高，并在真皮和皮下脂肪组织形成微脓肿样脂膜炎病变［16］。尽管以上研究与SLE病理特点吻合，但由于小鼠样本太少，且与本研究结论相反，因此本研究得到G0S2基因表达下调的结论，有待扩大样本量或采用人类患者样本进一步研究。

综上所述，SLE 是一个免疫细胞过度活化并又过度凋亡的持续增强的圆环反馈过程，最终引起一系列临床表现，进一步探索SLE 发病机制及靶向治疗迫在眉睫。